吳 杰，吳樹(shù)清，李東興，劉艷琴，張明月，海 巖

羊種布魯菌omp25的原核表達(dá)與免疫原性檢測(cè)＊

吳 杰1，吳樹(shù)清1，李東興1，劉艷琴1，張明月1，海 巖2

目的在大腸桿菌中表達(dá)羊種布魯菌omp25基因并鑒定重組蛋白的免疫原性。方法從羊種布魯菌中用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）擴(kuò)增得到布魯菌omp25基因片段，并將目的基因插入原核表達(dá)載體PET－32a中，構(gòu)建重組質(zhì)粒PET－32a／omp25轉(zhuǎn)入大腸桿菌E．coli Rosetta中并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，用SDS－PAGE和western－blot檢測(cè)表達(dá)蛋白。結(jié)果成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒PET－32a／omp25，并在大腸桿菌Rosetta中獲得了重組蛋白，重組蛋白與布魯菌陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。結(jié)論重組質(zhì)粒PET－32a／omp25可以在大腸桿菌Rosetta中成功表達(dá)，并且重組蛋白可與布魯菌陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，說(shuō)明該重組蛋白有良好的免疫原性，該研究為疫苗的研制及布魯菌病的檢測(cè)打下良好的基礎(chǔ)。

布魯菌；omp25；表達(dá)；免疫原性

布魯菌病是由布魯菌屬細(xì)菌引起的動(dòng)物源性疾病，是一種人畜共患傳染性疾病，該病在我國(guó)發(fā)病呈逐年上升趨勢(shì)［1］。它主要引起人類波狀熱和慢性感染以及反芻動(dòng)物流產(chǎn)和睪丸炎等，對(duì)于慢性布魯菌病目前尚無(wú)根治方法。大量研究表明，布魯菌的外膜蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性［2－3］。omp25是布魯菌omp A家族成員之一，omp25基因在布魯菌各個(gè)種屬之間有很高的保守性［4］。本研究克隆了羊種布魯菌omp25基因，在大腸埃希菌Rosetta中表達(dá)，用純化的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行western－blot分析，發(fā)現(xiàn)重組蛋白具有免疫原性。為檢測(cè)布魯菌病及研制布魯菌亞單位疫苗提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌株和質(zhì)粒 羊種布魯菌分離株于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院P2實(shí)驗(yàn)室分離鑒定。該分離株在羊流產(chǎn)胎兒中分離培養(yǎng)，經(jīng)染色鏡檢，生化鑒定和PCR檢測(cè)，最終確定該菌株為羊種布魯菌生物3型，命名為M306。PET－32a、Rosetta購(gòu)自大連寶生物有限工程公司。

1．1．2 試 劑 T4 連 接酶、DNA Marker、蛋 白Marker、IPTG和限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ、XhoⅠ購(gòu)自大連寶生物生物制品有限公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記兔抗羊IgG購(gòu)自Sigma公司，His GraviTrap Kit購(gòu)自GE公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成，濃度2OD／管，儲(chǔ)存液濃度100μmol／L。布魯菌標(biāo)準(zhǔn)陰性，陽(yáng)性羊血清由內(nèi)蒙古動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供，其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)試劑。

1．2 方法

1．2．1 目的片段的擴(kuò)增 根據(jù)GenBank上發(fā)表的16M布魯菌omp25的基因序列設(shè)計(jì)羊種布魯菌上下游引物 P1：5′cgcctcgagttagaacttgtagt 3′，P2：5′ccgggatccatgaaatccgtaat 3′（分別加入Eco RⅠ和Xho lⅠ酶切位點(diǎn)）。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s，55℃復(fù)性45 s，72℃延伸45 s；30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。同時(shí)設(shè)去離子水對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并觀察結(jié)果。

1．2．2 omp25基因表達(dá)載體的構(gòu)建 PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ、XhoⅠ雙酶切處理，1%瓊脂糖凝膠電泳，回收預(yù)期的omp25基因片段與同樣處理的PET－32a表達(dá)載體16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化至Rosetta中，涂LB平板（氨芐青霉素和氯霉素抗性），37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單克隆菌落37℃過(guò)夜搖菌，堿變性法提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和Eco RⅠ、Xho lⅠ雙酶切鑒定。挑取陽(yáng)性單克隆，送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，并與GenBank報(bào)道的omp25基因序列進(jìn)行同源性比較。將重組質(zhì)粒命名為PET－32a／omp25。

1．2．3 PET－32a／omp25重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 含重組質(zhì)粒的菌液按1∶100的量接種在的LB培養(yǎng)基中（含氨芐青霉素，氯霉素50μg／m L），37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0．6～1．0，再加入IPTG終濃度為1 mmol／L。37℃繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)12%的分離膠檢測(cè)表達(dá)情況。將誘導(dǎo)產(chǎn)物經(jīng)離心收集菌體，超聲處理，利用His GraviTrap Kit試劑盒，對(duì)融合蛋白進(jìn)行重力流純化，對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS－PAGE分析。

1．2．4 表達(dá)產(chǎn)物的純化和 Western－blot檢測(cè) 純化蛋白經(jīng)SDS－PAGE后電轉(zhuǎn)到NC膜上（50 m A，80 min），5%的脫脂奶粉4℃封閉過(guò)夜，布魯菌陽(yáng)性血清由5%的脫脂乳1／100倍稀釋作為一抗，37℃作用2 h，按1∶3 000倍稀釋的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗羊IgG作為二抗，37℃作用1 h，DAB顯色3～5 min后用自來(lái)水終止。

2 結(jié) 果

2．1 重組表達(dá)質(zhì)粒PET－32a／omp25的鑒定 PET－32a／omp25重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和Eco RⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，得到了預(yù)期大小的642bp片段。測(cè)序結(jié)果表明目的基因omp25正向插入PET－32a載體，并且測(cè)序結(jié)果與GenBank中公布的M16株布魯菌omp25基因序列完全相同（圖1）。

圖1 重組質(zhì)粒PET－32a－omp25的PCR及雙酶切鑒定Fig．1 Digestion analysis and PCR amplification of the recombinant plasmid PET－32a－omp25 M，M＊：DNA marker；1：negative control；2：PCR application of recombination plasmid PET－32a／omp25；3：PET－32a／omp25 cleaved by Eco RⅠ、Xho lⅠ

2．2 重組蛋白o(hù)mp25的表達(dá) 陽(yáng)性重組菌液在OD0．8時(shí)經(jīng)1 mmol／L IPTG 誘導(dǎo)5 h，進(jìn)行12%SDS－PAGE電泳分析，出現(xiàn)了大小約為43 k Da的蛋白條帶與預(yù)期分子量基本一致（圖2）。

圖2 表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGEFig．2 SDS－PAGE of expression productions M：protein marker；1，2：PET－32a／omp25 induced 5h；3：PET－32a（＋）induced 5h，4：E．coli Rosetta induced 5 h

2．3 重組蛋白o(hù)mp25的純化及western－blot分析

采用GE公司的His GraviTrap親和純化試劑盒對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，將收集的洗脫液進(jìn)行SDSPAGE電泳檢測(cè)。在約43 k Da可見(jiàn)純化的蛋白條帶（見(jiàn)圖3）。Western－blot分析結(jié)果表明，純化的重組蛋白能與羊種布魯菌陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，43 k Da處出現(xiàn)特異免疫反應(yīng)條帶由此表明重組蛋白o(hù)mp25有好的免疫原性（圖3）。

圖3 表達(dá)純化產(chǎn)物的SDS－PAGE及western－blot分析Fig．3 SDS－PAGE and western－blot analysis of purified products M：Protein marker；1：the purified recombinant protein；2：identification by western－blot

3 討 論

omp25是布魯菌外膜結(jié)構(gòu)蛋白［5］，是具有代表性的第3組外膜蛋白［6］。在布魯菌各個(gè)種屬之間具有高度的保守性，同源性達(dá)98%以上。布魯菌omp25基因的缺失可引起布魯菌的毒力減弱，并能夠?qū)λ拗髌鸬矫庖弑Ｗo(hù)作用［7］。Philpper從B．a(chǎn)bortus544基因庫(kù)中，以抗omp25單克隆抗體調(diào)出了omp25基因，并分析了其脫氧核糖核昔酸序列omp25基因長(zhǎng)約917bp，在起始密碼子6個(gè)堿基前有7個(gè)核昔酸序列（TAAGGAG）與大腸桿菌16sRNA序列具有同源性，估計(jì)是核糖體結(jié)合位點(diǎn)［8］。布魯菌細(xì)胞壁膜結(jié)構(gòu)是大多數(shù)細(xì)菌識(shí)別宿主的獨(dú)特標(biāo)志物，能綁定胞外的許多基質(zhì)蛋白，特別是纖維連接素和玻璃體粘連蛋白，這也是許多其他的病原微生物普遍存在的一個(gè)屬性。研究證實(shí)布魯菌表面主要的抗原成分是LPS和omps。到目前為止，己發(fā)現(xiàn)有7種主要omps，它以共價(jià)鍵的形式與細(xì)胞外膜的膚聚糖（PG）層緊密結(jié)合。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)omp25蛋白表達(dá)量高，占總菌體蛋白的含量高，具有良好的免疫反應(yīng)原性，具備作為免疫學(xué)活性抗原的潛力和優(yōu)勢(shì)，為疫苗的開(kāi)發(fā)和免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立，提供了候選抗原。

［1］文學(xué)忠，于瑞華，姜秋杰．布魯氏菌病近況［J］．吉林畜牧獸醫(yī)，2007（5）：20－23．

［2］Bowden R A，Cloeckaert A，Zygmunt M S，et al．Evaluation of immunogenicity and protective activity in BALB／c mice of the 25－k Da major outer－membrane protein of Brucella melitensis（OMP25）expressed in Escherichia coli［J］．J Med Micobiol，1997，47：39－48．

［3］Brocker B J，Tabatabai L B，Mayfeld J E．Conserbation of antigenicityin a 31－k Da Brucella protein ［J］．Vet Microbiol，1988，18：313－525．

［4］Matthew D，Edmonds，Cloeckaert A，Phlip HE．Brucella species lacking the major outer membrane protein Omp25 are attenuated in mice and protect against Brucella ovis［J］．Vet Micobiol，2002，88：205－221．

［5］Bowden R A，Verger J M，Grayon M，et al．Rspid identification of rough Brucella isolates bu a latex coagglutination assay with the 25－lilodalton outer membrane protein and rough－lipopolysaccharide specific monoclonal antibodies［J］．Clin Diagn Lsb Innunol，1997，4（5）：611－614．

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［8］Cloeckaert A，Zymunt M S，Wergifosse P，et al．Demonstration of pertidoglycan－associated Brucella outer－membrane proteins by use of monoclonal antibodies［J］．Gen Microbiol，1992，（138）：1543－1550．

Expression and immunogenicity of the recombinant protein omp25 of Brucella melitensis strain

WU Jie1，WU Shu－qing1，LI Dong－xing1，LIU Yan－qin1，ZHANG Ming－yue1，HAI Yan2

（1．College of Veterinary Medicine，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018；2．Inner Mongolia Center for Disease Control and Prevention，Hohhot 010010，China）

To express omp25 gene of Brucella in E．coli Rosetta and detect the immunogenicity of the recombinant protein，the target fragment of omp25 gene was amplified by PCR from the B．melitensis M306 strain and was cloned into expression vector PET－32a．After transforming into competent E．coli Rosetta and inducing by IPTG，the recombinant protein was expressed．As detected by SDS－PAGE and western－blot，this recombinant protein has immunogenicity．It was confirmed DNA sequencing and restriction enzymes cleavage that the recombinant plasmid PET－32a／omp25 was constructed successfully．Furthermore，the result of SDS－PAGE and western－blot assay showed that PET－32a／omp25 was expressed successfully in E．coli Rosetta and the recombinant protein could react with B．melitensis positive serum．This study provides a good foundation for the diagnosis of brucellosis and the preparation of new types of vaccines of Brucella．

Brucella；omp25；expression；immunogenicity

R378．5

A

1002－2694（2012）03－0241－03

＊國(guó)家“十一五”重點(diǎn)科技支撐項(xiàng)目（2006BAD04A16－4）

吳樹(shù)清，Email：wushuqing2009＠126．com

1．內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018；2．內(nèi)蒙古疾病預(yù)防控制中心，呼和浩特 010010 Email：wujie＿de＠yeah．net

2011－05－06；

2011－09－22