蔡燕麗，羅 雷，2，鄭學禮

廣州市白紋伊蚊細胞色素C氧化酶亞基Ι基因遺傳多態(tài)性分析＊

蔡燕麗1，羅 雷1，2，鄭學禮1

目的 探索廣州市白紋伊蚊線粒體細胞色素C氧化酶亞基I基因（COI）序列的特征，分析同一城市不同環(huán)境下白紋伊蚊的遺傳變異。方法單蚊抽提廣州市不同點采集的白紋伊蚊基因組DNA，擴增細胞色素C氧化酶亞基I基因片段，聯(lián)合單鏈構象多態(tài)性PCR（PCR－SSCP）技術分析COI基因片段多態(tài)性并篩選部分樣品進行克隆測序，用軟件比對分析序列的差異。結果廣州市不同采樣點白紋伊蚊PCR擴增后獲得709 bp的COI基因部分序列，序列分析出現(xiàn)12個變異位點，變異率為1．69%。聚類分析顯示廣州株白紋伊蚊不同采樣點的群體間出現(xiàn)部分分化。結論廣州市不同采樣點的白紋伊蚊線粒體COI基因出現(xiàn)部分遺傳多態(tài)性，可能與城市化發(fā)展下白紋伊蚊孳生環(huán)境的變化有一定關系。

白紋伊蚊；單鏈構象多態(tài)性；mtDNA－COI；城市化

蚊蟲作為一類常見的病媒生物，能傳播包括流行性乙型腦炎（Epidemic encephalitis B）、登革熱（Dengue fever，DF）和瘧疾（Malaria）等多種蟲媒傳染病，其傳播病原體的有效性與蚊蟲本身的媒介易感能力相關［1］。在自然界中登革病毒（Dengue virus，DENV）的傳播主要依賴埃及伊蚊（Aedes aegypti）和白紋伊蚊（Aedes albopictus），其媒介易感性是登革熱和登革出血熱（Dengue haemorrhagic fever，DHF）流行動態(tài)的影響因素之一。白紋伊蚊和埃及伊蚊在我國均有分布，其中白紋伊蚊由于其分布廣、活動時間長，對于我國大部分地區(qū)登革熱的流行起著重要的作用［2］。自1978年國內首次報道由登革4型病毒引起的廣東省佛山市登革熱暴發(fā)后，我國南方地區(qū)廣東、廣西、海南、福建和浙江等地都發(fā)生過登革熱流行［3］。廣州市地處亞熱帶，氣候溫暖潮濕，雨量充沛，十分適宜白紋伊蚊的生存繁殖，加上城市化發(fā)展快，人口密度高、流動大，近年來成為廣東省登革熱報告病例數(shù)最多的城市［4］。因此控制登革熱流行的措施除了登革疫苗的研制及相關臨床手段外，還包括其傳播媒介的有效控制，特別是白紋伊蚊的種群動態(tài)特征及不同環(huán)境下其遺傳結構的差異或者改變，對于制定白紋伊蚊防控措施有重要參考價值。

國內外針對白紋伊蚊不同群體遺傳多樣性的研究應用了多種分子遺傳標記和技術進行分析。其中線粒體細胞色素C氧化酶亞基I基因（mt DNACOI）序列組成保守，嚴格遵循母系遺傳，進化速率比核DNA快和無重組等特點，使其成為研究分子進化遺傳常用分子標記靶點，并運用于建立物種鑒定的DNA條形碼系統(tǒng)的研究［5］。本課題主要研究廣州市不同采樣點白紋伊蚊線粒體細胞色素C氧化酶亞基I基因的序列的多態(tài)性，探討不同群體的COI基因分化及遺傳差異，為廣州市白紋伊蚊種群監(jiān)測提供依據。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 白紋伊蚊樣本 現(xiàn)場采集廣州市10個區(qū)和2個縣級市12個點的白紋伊蚊成蚊和幼蟲。成蚊根據形態(tài)特征鑒定后置70%乙醇中保存，幼蟲帶回實驗室常規(guī)飼養(yǎng)至羽化后鑒定，置70%乙醇中保存?zhèn)溆谩悠穪碓醇安杉丨h(huán)境信息見表1。

1．1．2 試劑與主要儀器dNTP、Ex Taq 酶、p MD18－T Vector試劑盒、TaqΙ內切酶、DNA Maker均購自Ta KaRa公司；質粒小提試劑盒和凝膠回收試劑盒購于美國Omega Bio－Tek公司；大腸埃希菌DH5α為本室保存；其余試劑為國產分析純。TGradient Thermoblock PCR 擴增儀 （Biometra），Mini－PROTEAN Tetra Cell 電泳儀 （Bio－Rad），Smart Spec 3000紫外分光光度計（Bio－Rad）。

1．2 方法

1．2．1 基因組 DNA 提取 根據 Black［6］等的方法，提取單蚊基因組DNA，操作步驟如下：單只蚊子在裂解液（0．1 mol／L NaCl，0．2 mol／L Sucrose，0．1 mol／L Tris－HCl，0．05 mol／L EDTA，0．05%SDS）中漂洗兩次，置于1．5 m L離心管中，加入25 μL裂解液并用塑料研磨棒研磨至勻漿狀，另加25 μL裂解液混合均勻。65℃孵育30 min。趁熱加入7μL 8 mol／L的醋酸鉀混勻。冰水浴中放置30 min后15 000 g冷凍離心15 min，將上清（約45 μL）吸到新離心管中，注意不要吸到沉淀。加入100 μL預冷無水乙醇混勻沉淀核酸，－20℃放置30 min。15 000 g冷凍離心15 min，棄上清，加入1 m L 75%預冷乙醇洗滌沉淀，棄上清后倒置濾紙上，37℃烘干。加入50μL滅菌超純水溶解，－20℃保存?zhèn)溆谩Ｗ贤夥止夤舛扔嫓yDNA濃度及純度，1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

表1 廣州市白紋伊蚊樣品采集地及環(huán)境信息Tab．1 Location and circumstance information from samples of A．albopictus collected in Guangzhou

1．2．2 白紋伊蚊COI基因的擴增 參考Folmer［5］等擴增 基因的通用引物，上下游引物分別為，LCO1490：5′－GGTCAACAAATCATAAAGATATTG G 3′， HCO2198： 5′TAAACTTCAGGGTGAC CAAAAAATCA－3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成。以單蚊DNA為模板擴增COI基因片段，采用25μL的反應體系：dd H2O 16μL，DMSO 2．5μL，10×PCR緩沖液2．5μL，脫氧核苷三磷酸（d NTPs，各2．5 mmol／L）2μL，上、下游引物（10 pmol／μL）各0．5μL，Taq酶（5 U／μL）0．5μL，DNA（100 ng／μL）0．5μL。反應條件：94 ℃預變性3 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。擴增產物經1．0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并切膠純化回收，產物置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．3 COI基因的酶切 20μL酶切反應體系：Taq I 1μL，10×Taq I Basal Buffer 2μL，0．1%BSA 2μL，純化的PCR產物12μL（≤1μg），dd H2O 3μL。65℃水浴1．5 h，取5μL酶切產物經1．5%瓊脂糖凝膠電泳驗證酶切成功。

1．2．4 SSCP篩選及分析 制作6%非變性聚丙烯酰胺凝膠（交聯(lián)度為29∶1）。取3μL酶切成功的產物和5μL甲酰胺變性上樣緩沖液混勻，96℃變性10 min后，立即置于冰浴中驟冷5 min以上，8μL全部上樣。電泳槽置冰水浴中90V恒壓電泳6 h后，取下凝膠，置于固定液中固定30 min，期間不斷搖晃凝膠。倒掉固定液，用超純水漂洗凝膠5 min×3次，再將其置于硝酸銀染色液中銀染30 min，棄銀染液用超純水漂洗凝膠5 min×3次后，置于顯色液中顯色至條帶清晰同時背景較低時立即停止顯色，超純水漂洗1次，觀察并拍照記錄結果。

1．2．5 COI基因測序及序列分析 根據SSCP分析結果，每個采樣點各選擇一個代表性樣品，共篩選不同采樣點及實驗室長期飼養(yǎng)株共13份COI基因片段，純化產物連接到p MD18－T載體上，16℃2 h。連接產物轉化DH5α感受態(tài)，接種到含有氨芐抗生素的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12～16 h，菌落PCR法初篩陽性克隆，挑取陽性菌落提質粒，PCR鑒定后測序。不同個體白紋伊蚊COI序列用DNAMAN軟件比對后去掉載體序列，結果登陸Gen－Bank數(shù)據庫與白紋伊蚊線粒體全序列（登錄號：NC＿006817．1）中COI序列進行比對分析，在BioEdit軟件中編輯后輸出，用Clustal X 1．81和 Mega 4．0軟件分析不同個體之間COI序列的多態(tài)性和構建系統(tǒng)進化樹。

2 結 果

2．1 白紋伊蚊COI目的片段的PCR擴增結果白紋伊蚊 基因 產物經 瓊脂糖凝膠電泳，在約700 bp處可見單一DNA條帶，與預期的片段大小吻合，且無非特異性條帶，說明該通用引物及反應條件具有較好的特異性，見圖1。

圖1 白紋伊蚊COI基因擴增產物Fig．1 PCR products of COI genes of A．albopictus M：DL2000 marker；1－12：A．albopictus samples from BY，CH，HD，HP，HZ，LG，LW，NS，PY，TH，YX，ZC；13：A．albopictus sample from Lab strain；14：Negative control

2．2 COI基因擴增產物的酶切及SSCP分析 擴增的COI基因片段為709 bp，經TaqΙ酶切后產生3個片段，大小分別為264 bp、252 bp和193 bp，見圖2。由于其中兩個片段大小僅相差12 bp，瓊脂糖凝膠電泳后可見每個樣品在250 bp附近的條帶亮度及大小均為另一條的2倍，即該條帶由264 bp的條帶和252 bp的條帶組成。不同采樣點白紋伊蚊的COI酶切產物經SSCP篩選，共篩選出12份不同采樣點的樣品及1份實驗室飼養(yǎng)株樣品，見圖3。

2．3 COI基因測序及變異分析 13個代表樣品COI堿基序列長度相同，均為709 bp。樣品序列與GenBank收錄的白紋伊蚊線粒體全序列（NC＿006817．1）進行比較，與其中編碼COI基因的序列相似性均達到98%以上。所得的COI序列中A、T、G、C 堿基的平均含量為 28．63%、38．79%、15．94%和16．64%，A＋T的平均含量為67．42%，明顯高于G＋C平均含量32．58%，符合昆蟲線粒體A、T堿基偏好性的基因規(guī)律。不同樣品的COI基因序列中出現(xiàn)12個變異位點（1．69%），其中9處出現(xiàn)轉換，包括5次A－G轉換，4次T－C轉換；3處出現(xiàn)顛換，包括2次A－C顛換，1次T－A顛換，見表2。遺傳差異分析表明不同采樣點白紋伊蚊樣品間的差異為0．0%～0．7%。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，廣州市不同采樣點白紋伊蚊線粒體COI基因存在個體差異，從化、番禺、南沙和增城采樣點的白紋伊蚊與天河單獨聚成一類，黃埔區(qū)獨立與其他采樣點的蚊株聚成一類，見圖4。

表2 白紋伊蚊COI基因序列的位點變異Tab．2 The mutation sites of COI gene sequences of A．albopictus

圖4 廣州市不同采樣點白紋伊蚊的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig．4 Phylogenetic analysis of A．albopictus from different collection sites in Guangzhou

3 討 論

白紋伊蚊（Aedes albopictus）屬長角亞目蚊科（Culicidae）伊蚊屬（Aedes），在我國分布廣泛，是多種病毒如登革病毒、基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV）和西尼羅河病毒（West Nile virus，WNV）重要傳播媒介［2］。白紋伊蚊群體遺傳多態(tài)性的形成與種群隔離的地理距離有關以外，環(huán)境對白紋伊蚊群體的變異及基因流模式的作用也是導致群體遺傳多樣性的原因。李春曉［7］等用RAPD技術研究北京、上海、成都、廣州和日本沖繩、長樂寺6個不同地理株12個個體的遺傳差異發(fā)現(xiàn)，同一地理株不同個體間、不同地理株不同個體間的遺傳距離有差異，特別是由于地理隔離因素出現(xiàn)的長樂寺和其他地理株出現(xiàn)的最大的遺傳距離，提示了不同地理株出現(xiàn)的分化與地理位置有密切關系。林巖［8］等探討了福建省內4個不同地理環(huán)境的白紋伊蚊r DNA ITS2的基因序列特征，發(fā)現(xiàn)不同地理區(qū)域的白紋伊蚊在r DNA ITS2區(qū)表現(xiàn)的遺傳多態(tài)性，推測這些差異與生態(tài)環(huán)境因素如海拔高度、氣溫、降雨量和濕度有一定關系。本課題中廣州市不同采樣點白紋伊蚊COI基因序列出現(xiàn)多態(tài)性，一方面推測與采樣點的分布有關，系統(tǒng)發(fā)育進化樹中從化、番禺、南沙和增城采樣點主要分布在廣州市非城市中心地帶，其人口密度和人口流動比城市中心較低，而它們與天河聚成一類，說明同一地理株不同群體間確實存在著自由基因流，而且可能與人群活動關系密切。另一方面黃埔區(qū)獨立與其他采樣點的蚊株聚成一類，暗示該采樣點的蚊株開始出現(xiàn)分化可能與白紋伊蚊的種群密度、蚊媒防控措施等人類活動在短期內影響其種群遺傳結構有關。

城市化發(fā)展與蚊媒的遺傳變異有一定的關系。分析城市化發(fā)展程度的指標包括人群密度、建筑物覆蓋率、植被覆蓋率和非人類宿主數(shù)量，不同城市化程度的地區(qū)使蚊媒的孳生地出現(xiàn)差異，可能導致蚊媒即使在一個小范圍的環(huán)境中也出現(xiàn)一定程度的分化［9］。Dacm［10］等分析了巴西某地區(qū)5個地點埃及伊蚊群體的差異程度和本地水平的基因流模式，發(fā)現(xiàn)埃及伊蚊在城市中心和郊區(qū)均具有較高的群體遺傳差異。Hubert［11］等在越南胡志明市中心和郊區(qū)5個地點收集了7份埃及伊蚊種群樣本分析其同工酶和微衛(wèi)星多樣性與登革2型病毒的易感性，發(fā)現(xiàn)旱季埃及伊蚊出現(xiàn)遺傳分化并具有更高的登革病毒感染率，提出雨季等環(huán)境因素和孳生地密度、滅蚊等人類活動因素均可在短時間內控制埃及伊蚊的種群遺傳結構。廣州市一直是登革熱暴發(fā)流行區(qū)，城市實施的滅蚊措施使白紋伊蚊的種群密度迅速下降，城市化程度高和人們生活習慣的變化使廣州市白紋伊蚊孳生環(huán)境發(fā)生變化可能是導致不同采樣點白紋伊蚊COI基因出現(xiàn)差異的原因，但這種改變是否能經過不同環(huán)境的選擇作用并在較長時間的淘汰作用下保留下來并引起顯著的遺傳變異，還需要深入的研究。綜上所述，白紋伊蚊種群的遺傳變異涉及多種因素的作用，而人類活動等影響種群遺傳結構的作用也應當成為蚊媒防控的重要依據，為以后的登革熱防控措施提供更全面的指導。

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Genetic polymorphism analysis of COI gene in Aedes albopictus from Guangzhou

CAI Yan－li1，LUO Lei1，2，ZHENG Xue－li1
（1．Department of Etiobiology，School of Public Health and Tropical Medicine，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China；2．Guangzhou Center for Disease Control and Prevention，Guangzhou 510080，China）

In order to study the sequence characteristics of mitochondrial cytochrome C oxidase subunit I gene（COI）in Aedes albopictus from Guangzhou and the genetic variation analysis of these mosquitoes from different circumstance in the city，single mosquito genomic DNA was extracted from Aedes albopictus of different populations for COI gene amplification．Representative samples were selected by analysis of single－strand of conformation polymorphism and subjected to sequencing and comparison with relevant sequences available in GenBank，with Clustal X 1．81 and Mega 4．0 analyzed the variability of target sequences．The obtained COI sequences were 709 bp in length，with 12 mutation sites and 1．69%mutation rate．Based on the phylogenetic tree，Aedes albopictus populations collected from different sites showed partial genetic differentiation．The results suggested that the partial genetic variation presented on COI gene of Aedes albopictus from different collection sites of Guangzhou is probably correlated with urbanization due to the change of breeding environment．

Aedes albopictus；SSCP；mtDNA－COI；urbanization

Zheng Xue－li，Email：zhengxueli2001＠hotmail．com

R384

A

1002－2694（2012）08－0781－05

10．3969／cjz．j．issn．1002－2694．2012．08．004

＊國家自然科學基金（No．30872198，No．30972566）和廣州市科技局基礎研究項目（No．2009J1－c161）聯(lián)合資助

鄭學禮，Email：zhengxueli2001＠hotmail．com

1．南方醫(yī)科大學公衛(wèi)學院病原生物學教研室，廣州510515；

2． ， 510440

Supported by the National Natural Science Foundation（No．30872198），and the Basic Research Program of Science ＆ Technology Bureau of Guangzhou City（No．2009J1－c161）

2012－01－05；

2012－02－26