光學(xué)探針在活體成像中的應(yīng)用

李戰(zhàn)軍（綜述） 張洪武（審校）

光學(xué)探針在活體成像中的應(yīng)用

李戰(zhàn)軍（綜述） 張洪武（審校）

光學(xué)成像；活體成像；模型，動物

【中國圖書資料分類法分類號 】R-33

近年來，隨著各種光學(xué)探針的不斷出現(xiàn)，非侵入性、可實(shí)時觀測的動物活體光學(xué)成像技術(shù)迅速發(fā)展。該技術(shù)能夠在不對活體動物造成額外損傷或僅產(chǎn)生微小損傷的前提下研究生理狀態(tài)下的生物活體，與傳統(tǒng)成像技術(shù)互補(bǔ)性強(qiáng)，日益收到國內(nèi)外學(xué)者的重視[1]。但小動物活體熒光成像目前仍面臨2個主要問題：①不透明的生物組織會吸收、反射和散射光子，并產(chǎn)生強(qiáng)烈的自發(fā)光，這些問題都會使信號采集和定量變得困難。②生物活體環(huán)境非常復(fù)雜，對成像用對比劑或發(fā)光探針的要求非?？量?。隨著光學(xué)探針的不斷改進(jìn)，人們在小動物活體熒光成像的基礎(chǔ)上開發(fā)了生物發(fā)光成像、上轉(zhuǎn)換發(fā)光成像、時間分辨發(fā)光成像、長余輝發(fā)光成像、多模式聯(lián)合發(fā)光成像多種方法。本文通過介紹各種光學(xué)成像技術(shù)的基本特點(diǎn)，對各種光學(xué)探針面臨的問題、最新研究進(jìn)展和發(fā)展方向作一綜述。

1 熒光成像

700～1000nm的近紅外光是有效的光學(xué)成像窗口。在這一近紅外光學(xué)成像窗口，生物組織的吸收較弱，而且生物組織幾乎不會產(chǎn)生近紅外熒光。最常見的有機(jī)近紅外熒光探針是聚甲炔類染料，其中五甲炔花青和七甲炔青色素是最常用的近紅外熒光染料。作為常見的無機(jī)熒光探針，量子點(diǎn)是無機(jī)半導(dǎo)體發(fā)光納米材料（＜10nm），已經(jīng)成為多功能的生物成像工具。量子點(diǎn)的獨(dú)特光學(xué)性質(zhì)包括[2]：①熒光波長連續(xù)可調(diào)；②量子產(chǎn)率高，吸收光譜寬，發(fā)射光譜窄；③Stokes位移大；④抗光漂白能力強(qiáng)；⑤多色量子點(diǎn)可用同一波長激發(fā)實(shí)現(xiàn)同時檢測。雖然抗體、多肽及其他功能分子使量子點(diǎn)能夠應(yīng)用于活體的腫瘤熒光成像，但光子組織穿透性差，深層組織自發(fā)熒光和光吸收、光反射、光散射等光學(xué)成像的固有問題仍然極大地限制了量子點(diǎn)在小動物活體熒光成像中的應(yīng)用。因此，人們開始研制近紅外發(fā)光的量子點(diǎn)，將動物組織的光吸收最小化，進(jìn)而改善量子點(diǎn)熒光信號的組織穿透性[3]。

傳統(tǒng)的熒光團(tuán)，尤其是有機(jī)染料，易于受到光漂白的影響。這些熒光團(tuán)的熒光信號在數(shù)分鐘內(nèi)的持續(xù)激發(fā)下明顯減弱。因?yàn)槿鄙匍L時間的光穩(wěn)定性，所以將傳統(tǒng)的熒光團(tuán)用作活體熒光標(biāo)記仍然存在一些障礙。而高能量的激發(fā)光存在光子穿透深度小和潛在光損傷等問題[4]。鑒于此，雖然熒光染料種類非常豐富，但是吲哚菁綠仍然是目前唯一一種被美國食品藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)的可以應(yīng)用于臨床的熒光染料[5]。作為活體熒光標(biāo)記，量子點(diǎn)也有自身的局限性。盡管最近的研究報(bào)道稱未發(fā)現(xiàn)Ⅱ～Ⅳ族量子點(diǎn)對實(shí)驗(yàn)鼠有明顯的活體毒性，但是要將量子點(diǎn)應(yīng)用于臨床，重金屬元素鎘的毒性是亟待解決的問題[6]。

2 生物發(fā)光成像

生物發(fā)光是指生物體發(fā)光或生物體提取物發(fā)光的現(xiàn)象，它不需要生物體對激發(fā)光的吸收，而是靠生物體產(chǎn)生的熒光素酶催化底物的氧化還原過程將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能的化學(xué)發(fā)光過程。生物發(fā)光最常用于評價表達(dá)熒光素基因的移植細(xì)胞的數(shù)量和定位。一般將表達(dá)熒光素基因的腫瘤細(xì)胞移植到模型動物體內(nèi)，注射合適的生物發(fā)光底物之后，產(chǎn)生的生物發(fā)光信號與腫瘤細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)，使得能夠通過生物發(fā)光現(xiàn)象原位動態(tài)地觀察腫瘤細(xì)胞的遷移、生長、增殖過程，為評價抗腫瘤藥物的有效性提供了一種強(qiáng)有力的工具[7]。Galkin等[8]利用生物發(fā)光原理研究TAE684分子對淋巴瘤的抑制作用，發(fā)現(xiàn)TAE684能夠抑制淋巴瘤細(xì)胞增殖。盡管生物發(fā)光活體成像在研究生物過程中具有非侵入性、可實(shí)時跟蹤監(jiān)控、極高的信噪比、信號強(qiáng)度與細(xì)胞增殖呈正相關(guān)等獨(dú)特優(yōu)勢，但自身也有很多局限性。常見的熒光素酶包括螢火蟲熒光素酶、Renilla熒光素酶、磕頭蟲熒光素酶和Gaussia熒光素酶，多數(shù)生物發(fā)光是藍(lán)色、綠色發(fā)光，不適合深層組織的活體生物發(fā)光成像。生物發(fā)光活體成像需要改變實(shí)驗(yàn)對象的遺傳基因，目前僅限于模型動物研究，不太可能直接應(yīng)用于人體[7]。

3 上轉(zhuǎn)換發(fā)光成像

典型的熒光過程是一個線性過程，具有Stokes位移現(xiàn)象，即吸收一個較短波長的光子，發(fā)射一個較長波長的光子。從能量的角度來說，典型熒光團(tuán)的發(fā)射光能量要小于激發(fā)光能量。與此不同的是，上轉(zhuǎn)換發(fā)光過程（upconversion）是一個非線性反Stokes過程，它能夠把較低能量的激發(fā)光轉(zhuǎn)換為較高能量的光發(fā)射。上轉(zhuǎn)換發(fā)光過程需要1個以上光子的參與。多光子激發(fā)造成上轉(zhuǎn)換發(fā)光過程的激發(fā)光光子能量小于發(fā)射光光子能量，造成激發(fā)光波長比發(fā)射光波長更長[9]。上轉(zhuǎn)換納米顆粒的基本結(jié)構(gòu)一般是將過渡金屬元素、稀土元素或錒系元素?fù)诫s進(jìn)入無機(jī)晶體基質(zhì)的晶格中。因?yàn)榇蠖鄶?shù)稀土元素（除La、Ce、Yb、Lu外）具有多個亞穩(wěn)態(tài)能級，稀土元素成為目前占據(jù)主導(dǎo)地位的上轉(zhuǎn)換摻雜元素?；|(zhì)材料能夠很大程度上決定上轉(zhuǎn)換發(fā)光的性質(zhì)和效率。共摻雜Yb（Ⅲ）/Er（Ⅲ）或Yb（Ⅲ）/Tm（Ⅲ）的NaYF4納米顆粒具有最高的上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率[10,11]。在980nm近紅外光激發(fā)下，NaYF4：Yb,Er的上轉(zhuǎn)換發(fā)光位置位于407nm、521nm、539nm、651nm。NaYF4：Yb,Tm 的 上 轉(zhuǎn) 換 發(fā) 光 位 置 位 于450nm、479nm、649nm[12]。

體外及活體實(shí)驗(yàn)均表明稀土摻雜的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米顆粒具有很好的生物相容性，因此，上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米顆粒比量子點(diǎn)更適合用于生物成像應(yīng)用。在近紅外區(qū)，生物組織幾乎沒有自發(fā)熒光，而上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米顆?？梢员坏湍芰康慕t外光激發(fā)，這樣不僅減小了對生物體造成的光損傷，改善了光學(xué)信號的組織穿透性，還有效地回避了與傳統(tǒng)熒光團(tuán)活體成像相關(guān)的大部分問題。上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料即使經(jīng)過數(shù)小時的持續(xù)激發(fā)仍然能夠保持很好的光穩(wěn)定性。另外，上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料不像量子點(diǎn)那樣存在間歇發(fā)光或閃爍現(xiàn)象，故可以觀察單個顆粒的發(fā)光成像[13]。上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料面臨的最大問題是上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率普遍較低，通常是用980nm的激光激發(fā)。一旦通過納米技術(shù)解決這一問題，上轉(zhuǎn)換納米發(fā)光材料是最有可能應(yīng)用于人體的納米發(fā)光探針。

作為一種新型的成像對比劑，上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米顆粒已應(yīng)用于多種體內(nèi)外成像實(shí)驗(yàn)中。Chatteriee等[14]的研究結(jié)果表明，聚乙烯亞胺包裹的50nm的NaYF4：Yb,Er納米顆粒可以應(yīng)用于大鼠深層組織成像。Idris等[15]應(yīng)用上轉(zhuǎn)換納米顆粒標(biāo)記跟蹤移植的細(xì)胞。以上研究提示上轉(zhuǎn)換納米顆粒在活體生物成像和活體診斷方面具有巨大的應(yīng)用潛力。

4 時間分辨發(fā)光成像

熒光壽命是指熒光分子被激發(fā)到激發(fā)態(tài)之后，在發(fā)射光子產(chǎn)生熒光之前停留在激發(fā)態(tài)的平均時間。常見的生物內(nèi)源熒光團(tuán)（自發(fā)熒光）、熒光染料、熒光蛋白、量子點(diǎn)等的熒光壽命非常短，一般在納秒數(shù)量級，而發(fā)光稀土配合物的熒光壽命卻長好幾個數(shù)量級，可以達(dá)到微秒（Yb、Nd）、毫秒（Tb、Eu）數(shù)量級（表1）[16]。利用飛秒激光技術(shù)和長壽命熒光探針，在關(guān)閉激發(fā)光一定時間之后，短壽命的背景熒光已經(jīng)衰減完畢，而長壽命的熒光探針還在繼續(xù)發(fā)射光子，此時采集熒光信號可以有效地屏蔽背景熒光信號。人們很早就認(rèn)識到熒光壽命是成像方法中一個十分有用的熒光參數(shù)，熒光壽命可以在任何使用熒光現(xiàn)象的場合得到應(yīng)用。但是由于需要借助高速電子設(shè)備和數(shù)據(jù)分析計(jì)算設(shè)備，直到20世紀(jì)末出現(xiàn)了更高級的儀器和激光技術(shù)（如瞬態(tài)熒光光譜儀、高靈敏度CCD相機(jī)和飛秒激光技術(shù)等）之后，時間分辨熒光成像的概念才開始出現(xiàn)[16]。目前，時間分辨已經(jīng)可以借助各種各樣的新型技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，如單光子和雙光子顯微鏡、內(nèi)鏡、斷層掃描等?；跁r間分辨原理的各種應(yīng)用報(bào)道開始大量出現(xiàn)。由于稀土配合物的熒光壽命長，所以大量的時間分辨報(bào)道集中于稀土配合物。盡管稀土發(fā)光配合物具有熒光壽命長、量子產(chǎn)率高、發(fā)射峰位置固定且很窄、發(fā)射光譜多樣（Tb綠光，Eu紅光，Nd、Er等近紅外發(fā)光）等優(yōu)點(diǎn)，但由于稀土配合物的激發(fā)光通常在紫外光區(qū)，而紫外光組織穿透性差，會造成生物組織光損傷，并不適合小動物活體成像，所以目前的時間分辨熒光成像仍主要停留在體外細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)[17]。但通過調(diào)節(jié)配體的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使稀土發(fā)光配合物的激發(fā)光延長到可見光區(qū)[18]。Sun等[19]制備的新型近紅外發(fā)光稀土配合物的激發(fā)光可以從紫外光區(qū)延伸到＞500nm的可見光區(qū)。一旦稀土配合物的激發(fā)光能夠高效地延伸到可見光區(qū)，應(yīng)用于小動物活體的時間分辨熒光成像必將取得巨大突破。

5 長余輝發(fā)光成像

長余輝發(fā)光材料有超長的發(fā)光壽命，目前多種顏色包括藍(lán)色、綠色、紅色長余輝發(fā)光材料生成工藝成熟，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商品化。經(jīng)可見光激發(fā)并移除激發(fā)光源后，其長余輝發(fā)光時間可持續(xù)達(dá)數(shù)小時到十幾小時。隨著納米科技的快速發(fā)展，納米尺寸的長余輝發(fā)光材料開始出現(xiàn)并不斷拓寬長余輝發(fā)光材料的應(yīng)用領(lǐng)域[20-22]。Chermont等[23]于2007年首先用分級法從溶膠凝膠法制備的近紅外長余輝發(fā)光材料Ca0.2Zn0.9Mg0.9Si2O6：Eu,Dy,Mn中分離出少量納米粉體，并將其用于小鼠活體發(fā)光成像。Maldiney等[24]報(bào)道了近紅外發(fā)光亮度更高的長余輝發(fā)光材料CaMgSi2O6：Eu,Mn,Pr的余輝發(fā)光亮度是Ca0.2Zn0.9Mg0.9Si2O6： Eu,Dy,Mn的4倍，提示可以在小鼠體內(nèi)觀察更長時間。

長余輝發(fā)光納米材料可以將發(fā)光材料的激發(fā)和發(fā)射過程分開，這樣不僅可以有效地避免激發(fā)光產(chǎn)生的生物自發(fā)光產(chǎn)生的背景，提高信噪比，還可以避免激發(fā)光對實(shí)驗(yàn)動物造成的光損傷。但是，長余輝材料一般需要在高溫條件下制備，難以制備單分散的、水溶性的、納米尺寸的長余輝材料，而且高溫制備的長余輝材料缺乏能夠連接功能分子的活性基團(tuán)。這些問題都極大地阻礙了長余輝發(fā)光材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

6 多模式聯(lián)合成像

活體光學(xué)成像技術(shù)組織穿透性差，三維空間分辨率低，但如果將活體光學(xué)成像與解剖學(xué)成像方法（如MRI和CT等）聯(lián)合使用，將有助于彌補(bǔ)光學(xué)成像的不足，并提供相互補(bǔ)充的信息?；诖?，多功能探針日益引起各國學(xué)者的密切關(guān)注，相關(guān)研究報(bào)道日益增多，如熒光-MRI雙模式成像[25]、上轉(zhuǎn)換發(fā)光-MRI雙模式成像[26]、熒光-PET雙模式成像[27]、熒光-SPECT雙模式成像[28]。實(shí)際上，多模式聯(lián)合成像是最有

可能成為光學(xué)成7 結(jié)束語

像最終應(yīng)用于臨床的應(yīng)用方式。

小動物活體光學(xué)成像有自身的獨(dú)特優(yōu)勢，可以和現(xiàn)有的醫(yī)學(xué)成像方法相互補(bǔ)充，為生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供有力的研究工具。不同的光學(xué)成像方法都有各自的優(yōu)點(diǎn)，同時也面臨一些問題。但活體光學(xué)成像的發(fā)展還依賴于性能更加優(yōu)異的發(fā)光探針。隨著新型發(fā)光探針的開發(fā)，活體光學(xué)成像技術(shù)必將成為應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域更強(qiáng)大的研究手段。

[1]Janib SM, Moses AS, MacKay JA. Imaging and drug delivery using theranostic nanoparticles. Adv Drug Deliver Rev, 2010, 62(11)： 1052-1063.

[2]Bruchez M, Moronne M, Gin P, et al. Semiconductor nanocrystals as fl uorescent biological labels. Science, 1998,281(5385)： 2013-2016.

[3]He Y, Zhong YL, Su YY, et al. Water-dispersed nearinfrared-emitting quantum dots of ultrasmall sizes for in vitro and in vivo imaging. Angew Chem Int Edit, 2011,50(25)： 5694-5697.

[4]Resch-Genger U, Grabolle M, Cavaliere-Jaricot S, et al.Quantum dots versus organic dyes as fl uorescent labels. Nat Methods, 2008, 5(9)： 763-775.

[5]He XX, Wang KM, Cheng Z. In vivo near-infrared fluorescence imaging of cancer with nanoparticle-based probes. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol,2010, 2(4)： 349-366.

[6]Hauck TS, Anderson RE, Fischer HC, et al. In vivo quantumdot toxicity assessment. Small, 2010, 6(1)： 138-144.

[7]Dothager RS, Flentie K, Moss B, et al. Advances in bioluminescence imaging of live animal models. Curr Opin Biotech, 2009, 20(1)： 45-53.

[8]Galkin AV, Mellnick JS, Kim S, et al. Identi fi cation of nvptae684, a potent, selective, and ef fi cacious inhibitor of npmalk. P Natl Acad Sci USA, 2007, 104(1)： 270-275.

[9]Ang LY, Lim ME, Ong LC, et al. Applications of upconversion nanoparticles in imaging, detection and therapy. Nanomedicine, 2011, 6(7)： 1273-1288.

[10]Wang F, Liu X. Recent advances in the chemistry of lanthanide-doped upconversion nanocrystals. Chem Soc Rev, 2009, 38(4)： 976-989.

[11]Kramer KW, Biner D, Frei G, et al. Hexagonal sodium yttrium fl uoride based green and blue emitting upconversion phosphors. Chem Mater, 2004, 16(7)： 1244-1251.

[12]Li Z, Zhang Y. Monodisperse silica-coated polyvinylpyrrolidone/nayf4 nanocrystals with multicolor upconversion fl uorescence emission. Angew Chem Int Edit,2006, 45(46)： 7732-7735.

[13]Park YI, Kim JH, Lee KT, et al. Nonblinking and nonbleaching upconverting nanoparticles as an optical imaging nanoprobe and t1 magnetic resonance imaging contrast agent. Adv Mater, 2009, 21(44)： 4467-4471.

[14]Chatteriee DK, Rufalhah AJ, Zhang Y. Upconversion fluorescence imaging of cells and small animals using lanthanide doped nanocrystals. Biomaterials, 2008, 29(7)：937-943.

[15]Idris NM, Li ZQ, Ye L, et al. Tracking transplanted cells in live animal using upconversion fluorescent nanoparticles.Biomaterials, 2009, 30(28)： 5104-5113.

[16]Berezin MY, Achilefu S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chem Rev, 2010,110(5)： 2641-2684.

[17]Zhao H, Gao F, Tanikawa Y, et al. Time-resolved diffuse optical tomography and its application to in vitro and in vivo imaging. J Biomed Opt, 2007, 12(6)： 062107.

[18]Xu J, Sun Z, Jia L, et al. Visible light sensitized attapulgitebased lanthanide composites： microstructure, photophysical behaviour and biological application. Dalton Trans, 2011,40(48)： 12909-12916.

[19]Sun L, Dang S, Yu J, et al. Near-infrared luminescence from visible-light-sensitized hybrid materials covalently linked with tris(8-hydroxyquinolinate)-lanthanide Er(III),Nd(III), and Yb(III) derivatives. J Phys Chem B, 2010,114(49)： 16393-16397.

[20]Cheng BC, Liu HJ, Fang M, et al. Long-persistent phosphorescent SrAl2O4：Eu2+, Dy3+nanotubes. Chem Commun, 2009, (8)： 944-946.

[21]Lu YY, Liu F, Gu ZJ, et al. Long-lasting near-infrared persistent luminescence from beta-Ga2O3：Cr3+nanowire assemblies. J Lumin, 2011, 131(12)： 2784-2787.

[22]Ma L, Chen W. Enhancement of afterglow in Zns：Cu,Co water-soluble nanoparticles by aging. J Phys Chem C, 2011,115(18)： 8940-8944.

[23]Chermont QL, Chaneac C, Seguin J, et al. Nanoprobes with near-infrared persistent luminescence for in vivo imaging. P Natl Acad Sci USA, 2007, 104(22)： 9266-9271.

[24]Maldiney T, Lecointre A, Viana B, et al. Controlling electron trap depth to enhance optical properties of persistent luminescence nanoparticles for in vivo imaging. J Am Chem Soc, 2011, 133(30)： 11810-11815.

[25]Bumb A, Regino CAS, Egen JG, et al. Traf fi cking of a dualmodality magnetic resonance and fluorescence imaging superparamagnetic iron oxide-based nanoprobe to lymph nodes. Mol Imaging Biol, 2011, 13(6)： 1163-1172.

[26]Xia A, Gao Y, Zhou J, et al. Core-shell NaYF4：Yb3+,Tm3+@FexOy nanocrystals for dual-modality T2-enhanced magnetic resonance and NIR-to-NIR upconversion luminescent imaging of small-animal lymphatic node.Biomaterials, 2011, 32(29)： 7200-7208.

[27]Liu SQ, Zhang B, Wang X, et al. A dual modality system for simultaneous fluorescence and positron emission tomography imaging of small animals. IEEE T Nucl Sci,2011, 58(1)： 51-57.

[28]Banerjee SR, Pullambhatla M, Byun Y, et al. Sequential spect and optical imaging of experimental models of prostate cancer with a dual modality inhibitor of the prostate-speci fi c membrane antigen. Angew Chem Int Edit,2011, 50(39)： 9167-9170.

10.3969/j.issn.1005-5185.2012.11.020

中國科學(xué)院“百人計(jì)劃”項(xiàng)目（09i4281c10）；國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（2010CB434800）。

中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所 福建廈門 361021

張洪武 E-mail： hwzhang@iue.ac.cn

2012-01-30

2012-07-18

（責(zé)任編輯 張春輝）