金佳美（綜述） 陳 明（審校）

超聲靶向微泡破裂在分子生物學(xué)中的應(yīng)用

金佳美（綜述） 陳 明（審校）

超聲靶向微泡破裂；基因療法；分子生物學(xué)

【中國(guó)圖書資料分類法分類號(hào) 】R445.1

超聲微泡自1968年由Gramiak及Shah報(bào)道發(fā)現(xiàn)至今，已廣泛應(yīng)用于提高超聲診斷的分辨力、敏感性和特異性。然而超聲微泡的作用并不僅僅局限于臨床超聲診斷，近年來(lái)，超聲靶向微泡破裂（ultrasound-targeted microbubble destruction, UTMD）技術(shù)在分子生物學(xué)領(lǐng)域迅速發(fā)展，利用微泡在超聲介導(dǎo)下的空化效應(yīng)可以達(dá)到靶向給藥、靶向治療的作用。Lawrie等[1]發(fā)現(xiàn)使用超聲聯(lián)合微泡造影劑對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率較裸露DNA增加了近3000倍。自此，UTMD在基因治療中的重要作用逐漸得到認(rèn)識(shí)和發(fā)展。本文就UTMD在分子生物學(xué)中的應(yīng)用最新動(dòng)態(tài)作一綜述。

1 UTMD的轉(zhuǎn)染原理

超聲波本身具有促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染的作用[1]，聯(lián)合使用超聲造影劑微泡可進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)染效率，其原理主要是目的基因通過(guò)表面黏附或內(nèi)部包裹的方式與微泡結(jié)合，然后通過(guò)超聲介導(dǎo)在靶細(xì)胞或組織中，由微泡靶向傳輸基因或藥物[2]，超聲波的空化效應(yīng)可以導(dǎo)致組織細(xì)胞膜通透性增高，而微泡又能降低超聲波的空化閾值，從而增強(qiáng)空化效應(yīng)，使局部毛細(xì)血管破裂，鄰近組織細(xì)胞間隙增寬，從而使目的基因更容易進(jìn)入組織細(xì)胞內(nèi)而提高局部組織及細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)，達(dá)到基因治療疾病的目的[3,4]。Hallow等[5]證明空化效應(yīng)釋放出強(qiáng)大的聲能，引發(fā)多種生物學(xué)效應(yīng)，形成聲孔。細(xì)胞膜出現(xiàn)暫時(shí)且可逆的小孔，使細(xì)胞外大分子能夠得以進(jìn)入細(xì)胞的現(xiàn)象稱為聲孔效應(yīng)，聲孔效應(yīng)可能是基因成功轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)。雖然空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)使細(xì)胞膜通透性增加是增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)染的主要原理，但UTMD促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染效率的確切機(jī)制尚不明確。Bekeredjian等[6]認(rèn)為目的基因的轉(zhuǎn)染也與超聲、質(zhì)粒及微泡的結(jié)合方式有關(guān)，由此可以認(rèn)為細(xì)胞膜通透性增加不是UTMD增加轉(zhuǎn)染效率的唯一機(jī)制，而是多因素影響的過(guò)程，其詳細(xì)機(jī)制仍在進(jìn)一步研究中。

2 UTMD在藥物傳輸中的應(yīng)用

超聲造影劑微泡可以通過(guò)不同方式攜帶藥物，通過(guò)特殊的聲孔效應(yīng)經(jīng)靜脈途徑靶向給藥，超聲輻照介導(dǎo)微泡造影劑定向釋放藥物，這種效應(yīng)可以改變藥物的分布，增加藥物局部濃度，減少不良反應(yīng)?？稻甑萚7]發(fā)現(xiàn)多西紫杉醇脂質(zhì)微泡聯(lián)合UTMD能抑制兔VX2肝癌的微血管生成，從而抑制兔VX2肝癌的生長(zhǎng)。

溶栓治療已經(jīng)成為超聲微泡藥物運(yùn)輸系統(tǒng)的應(yīng)用方向，在理想條件下，超聲聯(lián)合微泡可以完全溶解血栓[8]。Flores等[9]發(fā)現(xiàn)將溶栓劑組織型纖溶酶原激活物和超聲微泡聯(lián)合應(yīng)用不僅能有效溶栓，還能顯著降低急性腦卒中患者的顱內(nèi)出血。

UTMD對(duì)于腫瘤、炎癥、血栓等都有顯著的治療效果，對(duì)多種組織器官的療效也在不同動(dòng)物模型中得以證實(shí)，相信在進(jìn)一步完善各項(xiàng)參數(shù)條件后，UTMD能夠真正運(yùn)用到臨床治療中。

3 UTMD在基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用

自2000年首次報(bào)道UTMD用于體外基因轉(zhuǎn)染以來(lái)，該技術(shù)在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均取得較顯著的效果，用于轉(zhuǎn)染各個(gè)系統(tǒng)臟器。作為一種非病毒轉(zhuǎn)染方法，UTMD較傳統(tǒng)的脂質(zhì)體、陽(yáng)離子聚合物等方法顯示出其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

3.1 UTMD在腫瘤基因治療中的應(yīng)用 目前常用的UTMD腫瘤基因治療方法主要有以下幾種：①自殺基因療法，又稱為基因介導(dǎo)的酶前藥物治療。Li等[10]發(fā)現(xiàn)超聲介導(dǎo)下自殺基因KDRP-CD/TK對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞有顯著的抑制作用。Zhou等[11]將單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）自殺基因微泡通過(guò)UTMD技術(shù)作用于小鼠肝癌模型，效果明顯。②抗腫瘤新生血管形成療法。Kou等[12]通過(guò)RNA干擾（RNAi）技術(shù)阻斷血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體后，腫瘤血管生成減慢。而通過(guò)UTMD技術(shù)完全可以靶向干預(yù)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體，得到相同甚至更佳效果。③基因替代療法。Luo等[13]利用UTMD將野生p53基因轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞，不僅較傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方法效率更高，抑制作用也顯而易見(jiàn)。④反義基因療法。載反義mRNA微泡經(jīng)超聲介導(dǎo)轉(zhuǎn)染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，經(jīng)檢測(cè)腫瘤特異蛋白表達(dá)水平顯著降低，充分說(shuō)明其抑制作用?？梢?jiàn)，UTMD在腫瘤基因治療中具有良好的應(yīng)用前景。

3.2 UTMD在組織器官基因治療中的應(yīng)用 除腫瘤外，在心血管[14]、肺[15]、腦[16]、脊髓[17]、子宮[18,19]、胰腺[20]、腎臟[21]、視網(wǎng)膜[22]、皮膚[23]、睪丸[24]等的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，UTMD均表現(xiàn)出安全和高轉(zhuǎn)染效率的優(yōu)點(diǎn)。UTMD 可高效、靶向轉(zhuǎn)染目的基因而無(wú)明顯組織損傷，是一種安全、簡(jiǎn)單、有應(yīng)用前景的非病毒基因傳輸方法。

4 UTMD的影響因素

UTMD對(duì)不同器官組織作用程度的不同會(huì)造成藥物傳輸及基因轉(zhuǎn)染效率的不同，主要受到3個(gè)方面的影響：一是介導(dǎo)超聲的參數(shù)；二是所使用微泡的特性；三是微泡輸入的途徑及超聲微泡作用局部的環(huán)境。

與超聲相關(guān)的參數(shù)變量有聲強(qiáng)、持續(xù)時(shí)間、頻率、束流截面、衰減作用等。對(duì)超聲參數(shù)的優(yōu)化主要體現(xiàn)在參數(shù)設(shè)定方面，即能夠產(chǎn)生足夠的聲能形成盡可能多的外溢孔，使得所傳輸?shù)乃幬锛盎蚰軌蜻M(jìn)入細(xì)胞及組織間隙中，提高藥物作用效能及基因轉(zhuǎn)染效率，但這應(yīng)基于在細(xì)胞組織耐受并不會(huì)產(chǎn)生明顯不良反應(yīng)的基礎(chǔ)上。因此，對(duì)超聲參數(shù)的優(yōu)化對(duì)于成功地應(yīng)用UTMD介導(dǎo)藥物傳輸或基因轉(zhuǎn)染都是至關(guān)重要的。在組織能耐受的情況下高聲強(qiáng)和低頻率超聲照射對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染是最為有效的[25]，且超聲輻照的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則微泡會(huì)因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的超聲輻照而被大量清除，使轉(zhuǎn)染效率降低[26]。Zarnitsyn等[27]采用pEGFP-N1及pGL3對(duì)DU145前列腺癌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以優(yōu)化轉(zhuǎn)染過(guò)程中聲強(qiáng)、微泡濃度、細(xì)胞密度、質(zhì)粒濃度、溫度、輻照時(shí)間等轉(zhuǎn)染條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，優(yōu)化后的超聲參數(shù)能夠在保證細(xì)胞耐受及DNA質(zhì)粒完好的條件下提高轉(zhuǎn)染效率。

微泡的性質(zhì)也是UTMD介導(dǎo)藥物傳輸及基因轉(zhuǎn)染的重要因素，只有適合的微泡才能完成運(yùn)輸轉(zhuǎn)染。微泡相關(guān)變量有微泡外殼成分構(gòu)成、微泡中氣體的性質(zhì)、劑量、濃度、輸注時(shí)間等，當(dāng)超聲微泡結(jié)合脂質(zhì)體或陽(yáng)離子聚合物時(shí)，也會(huì)明顯增加轉(zhuǎn)染效率[19]。除自制的微泡外，獲批上市的微泡造影劑有 SonoVue、Levovist、Optison、De fi nity、Sonazoid及biSphere等。Wang等[28]用攜帶綠色熒光的DNA質(zhì)粒分別與SonoVue、Optison和Levovist混合，結(jié)果顯示，Optison在沒(méi)有超聲介導(dǎo)的條件下即能夠提高轉(zhuǎn)染效率。在超聲輻照的條件下，Optison也能夠提高基因轉(zhuǎn)染效率，但是與僅使用Optison造影劑條件下的轉(zhuǎn)染率無(wú)明顯差異。而SonoVue在聯(lián)合超聲輻照后，轉(zhuǎn)染效率較單獨(dú)使用時(shí)明顯增加。只有Levovist無(wú)論是否結(jié)合超聲輻照對(duì)轉(zhuǎn)染效率均無(wú)明顯益處，在沒(méi)有超聲輻照的條件下反而會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率，而且較SonoVue及Optison的安全性低。Optison及SonoVue能提高轉(zhuǎn)染效率在很大程度上與其自身化學(xué)組成有關(guān)，Optison微泡的白蛋白外殼及八氟丙烷氣體、SonoVue微泡的磷脂外殼及六氟化硫氣體不同于Levovist微泡的半乳糖外殼及空氣，帶正電荷的白蛋白及陽(yáng)離子脂質(zhì)體均有助于基因轉(zhuǎn)染，而且全氟化碳?xì)怏w溶解度比空氣低，保證其穩(wěn)定性更佳，同樣擁有脂質(zhì)體外殼及全氟化碳?xì)怏w的De fi nity微泡對(duì)基因轉(zhuǎn)染也起促進(jìn)作用，證明了這一點(diǎn)[29]。而SonoVue結(jié)合超聲能夠進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)染效率是因?yàn)槌曌饔脮r(shí)產(chǎn)生的聲孔效應(yīng)比作用于Optison的轉(zhuǎn)染過(guò)程更為明顯。故建議在基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中選用SonoVue、Optison及De fi nity等白蛋白或脂質(zhì)體外殼，全氟化碳?xì)怏w的微泡造影劑更為適合。Li等[30]分別比較Optison、Imagent和De fi nity 3種超聲微泡對(duì)心肌血管通透性的作用，結(jié)果顯示，3種微泡對(duì)微血管損害的潛在性無(wú)明顯差異，僅De fi nity組有較多的微血管滲出。

由于UTMD介導(dǎo)轉(zhuǎn)染還受到造影劑給藥途徑、轉(zhuǎn)染部位、超聲儀器等因素的影響，對(duì)UTMD各方面影響因素的限定至今仍無(wú)法達(dá)成共識(shí)。

5 UTMD的安全性

自超聲造影劑問(wèn)世以來(lái)，其安全性備受關(guān)注。2007年，F(xiàn)DA要求在超聲微泡造影劑標(biāo)簽上加上黑框警告，以警告其有引起嚴(yán)重心肺反應(yīng)的危險(xiǎn)，因?yàn)橛?例患者在注射造影劑當(dāng)時(shí)或之后30min內(nèi)死于心臟驟停，還有一些患者發(fā)生嚴(yán)重但非致死性的心肺并發(fā)癥。但一系列大規(guī)?；仡櫡治鯷31,32]證明了超聲微泡造影劑使用的安全性后，F(xiàn)DA修改了黑框警告。

UTMD技術(shù)所要求的超聲參數(shù)與診斷用超聲不同，為高聲強(qiáng)、低頻率、高強(qiáng)度超聲，會(huì)引起組織細(xì)胞不可逆的損傷[33,34]。此外，超聲聯(lián)合微泡所產(chǎn)生的空化作用，即在微泡破裂的瞬間所釋放出的巨大聲能與高溫，都會(huì)使組織細(xì)胞受損傷的風(fēng)險(xiǎn)大大增加，已有超聲聯(lián)合微泡引起組織出血、血管內(nèi)溶血、體外培養(yǎng)細(xì)胞和含氣組織及器官損傷的報(bào)道[35]。并有學(xué)者認(rèn)為UTMD還能通過(guò)局部產(chǎn)生自由基和微射流，引起血管內(nèi)皮損傷，進(jìn)一步損傷細(xì)胞和組織。

目前絕大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為UTMD較病毒轉(zhuǎn)染方式相對(duì)安全。Hynynen等[36]將去除部分顱骨的新西蘭兔作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，采用超聲?lián)合微泡造影劑對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷哪X部進(jìn)行20s輻照，聲強(qiáng)為16 ～ 690W/cm2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，聯(lián)合微泡超聲局部輻照可使血-腦屏障短暫地、可逆地開(kāi)放，并不引起損傷。此外，大多數(shù)關(guān)于UTMD的實(shí)驗(yàn)多采用離體器官或細(xì)胞為研究對(duì)象，使用劑量遠(yuǎn)大于臨床所需劑量。所以UTMD在藥物傳輸及基因轉(zhuǎn)染過(guò)程中對(duì)人體產(chǎn)生損傷的概率應(yīng)該很低。

6 UTMD的應(yīng)用前景

目前基因治療需要尋找一種安全、高效、可重復(fù)、靶向性強(qiáng)的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，而UTMD技術(shù)的出現(xiàn)正可以解決這個(gè)難題，雖然該技術(shù)的效率相對(duì)于病毒轉(zhuǎn)染方式很低，但是它克服了病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞毒性及免疫原性問(wèn)題，創(chuàng)傷小、安全性高，也可以直接攜帶藥物進(jìn)行治療，在分子生物學(xué)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

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10.3969/j.issn.1005-5185.2012.11.021

同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院心臟中心 上海200120

陳 明 E-mail： mingchen1283@vip.163.com

2012-01-10

2012-08-03

（責(zé)任編輯 張春輝）