徐 鑫 徐羅康 季愛芳 趙海坤

（1.江蘇省東臺市農(nóng)產(chǎn)品質量檢測中心，東臺 224200；2.江蘇省常州市生態(tài)技術應用研究所，常州 213131）

豬圓環(huán)病毒2型是近幾年來發(fā)現(xiàn)的一種單鏈環(huán)狀DNA病毒，該病與豬的多種疾病綜合征有關，該病毒主要引起斷奶豬多系統(tǒng)衰竭綜合征，導致豬體免疫抑制，從而繼發(fā)或并發(fā)其他疾病。豬圓環(huán)病毒最早于1991年在加拿大發(fā)現(xiàn)，而后迅速蔓延到世界各地。國外資料顯示，絕大多數(shù)豬群呈血清學陽性[1]。目前，由圓環(huán)病毒引發(fā)豬的多種綜合征已成為導致養(yǎng)豬場經(jīng)濟損失的主要原因之一，是養(yǎng)豬業(yè)面臨的殺手。東臺地區(qū)自2006年以來，一直連續(xù)發(fā)生“生豬高熱病”，給東臺養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，疫情嚴重的鄉(xiāng)鎮(zhèn)豬的存欄量減少了60%以上，不少中小型豬場因此而倒閉[2]。本次流行病學調(diào)查旨在通過對東臺地區(qū)豬血清樣本進行檢測，系統(tǒng)分析PCV2在豬群中的感染及流行規(guī)律，為PCV2的防治提供科學依據(jù)，為制定科學防控措施提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

6.4 μg/ml重組蛋白抗原；標準小牛血清為杭州四季青生物制品公司產(chǎn)品；羊抗豬IgG酶標抗體（HRP）為Rockland公司產(chǎn)品（使用前1∶5000稀釋）；低分子量蛋白標樣為Fermentas公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白（BSA）購自華美生物工程公司

分析純級國產(chǎn)化學試劑：包被緩沖液（0.05M，Na2CO3/ NaH CO3，pH9.6）、PBS（每1 000 ml去離子水中NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO41.44 g，KH2PO40.24 g，pH7.4）、PBST（0.01 mol/L，pH7.4，PBS+0.5% Tween-20）、底物溶液（24.3 ml 0.1mol/L檸檬酸、25.7 ml 0.2mol/L 、Na2HPO4、50 mlDDW）、2 mol/L H2SO4；

實驗室保存的PCV2陽性血清、PCV2陰性血清。

1.1.2 待檢樣品的來源與處理

被檢血清樣本采自東臺市東蹲片、東南片、安梁富片、堤西片、市區(qū)（屠宰場）5個不同地區(qū)，采集范圍覆蓋全市24個鎮(zhèn)、區(qū)計50個豬場、1個屠宰場。除經(jīng)產(chǎn)母豬采用耳靜脈采血外，其余豬全部采用前腔靜脈采血法無菌采血，3～5 ml/頭，以4 000 r/min的速度離心5 min后共獲得血清249份，－20℃保存?zhèn)溆?。采樣豬包括經(jīng)產(chǎn)母豬、屠宰豬、中等大育肥豬、斷奶仔豬及哺乳仔豬，所有采樣豬均為未免疫豬。

1.2 方法

1.2.1 試驗方法

采用已建立的間接 ELISA檢測法。

1.2.2 試驗步驟

在聚苯乙稀微孔酶標板上，先用純化好的重組蛋白在最適包被條件下包被酶標板，封板膜封板4 ℃過夜；再在96孔U形底聚丙微量板上用PBS分別將待檢血清作1∶40稀釋；將包被好的酶標板傾去孔內(nèi)液體，用PBST（0.01 mol/L，pH7.3，PBS+0.5% Tween-20）洗滌3次，5 min/次，在吸水紙上拍干，加入5%牛血清封閉液，200 μL/孔，37 ℃反應3 h；封閉后，與前面一樣進行洗滌，分別加入稀釋好的待檢血清100 μL/孔加入酶聯(lián)反應板，同時作PCV2陽性血清和陰性血清對照，37 ℃反應2 h；洗滌后，加入1∶5 000稀釋的HRP-羊抗豬IgG二抗，100 μL/孔，在37 ℃反應2 h；洗滌后每孔加入新鮮配制的底物溶液100 μL，37 ℃顯色15 min，加2 mol/L H2SO4100 μL終止液終止反應，在酶聯(lián)檢測儀上讀處OD490值，進行結果判定。

2 結果與分析

2.1 血清樣品數(shù)量

共獲得249份豬血清，其中經(jīng)產(chǎn)母豬血清28份，屠宰豬血清21份，中豬血清100份，斷奶仔豬血清60份，哺乳仔豬血清40份。

2.2 檢測結果

按照研究已建立的間接ELISA檢測方法及其陰陽性臨界值的確定原則，即樣本OD490≥0.4，判定為陽性，樣本OD490＜0.4的判定為陰性。通過對249份豬血清的檢測，共發(fā)現(xiàn)PCV2抗體陽性血清175份，其中經(jīng)產(chǎn)母豬陽性血清26份，屠宰豬陽性血清17份，中豬陽性血清69份，斷奶仔豬陽性血清34份及哺乳仔豬陽性血清29份；不同區(qū)域豬血清陽性率不相同，東蹲區(qū)80.88%，東南區(qū)70%，安梁富區(qū)65%，堤西區(qū)55%以及市區(qū)80.95%；這次試驗所檢測的豬血清樣品采自于東臺地區(qū)51個豬場（其中20個規(guī)模場、30個散養(yǎng)場、1個屠宰場），分布于東臺5個區(qū)（東蹲區(qū)、東南區(qū)、安梁富區(qū)、堤西區(qū)、市區(qū)），共有陽性豬場51個，陽性豬場率為100%；經(jīng)產(chǎn)母豬抗體陽性率92.86%，屠宰豬抗體陽性率80.95%，中豬抗體陽性率69%，斷奶仔豬抗體陽性率56.67%及哺乳仔豬抗體陽性率72.5%，總平均陽性率為70.28%；不同養(yǎng)殖方式豬血清陽性率不同，規(guī)模場73.91%，散養(yǎng)場62.22%。

結果顯示，不同生長階段豬群和不同規(guī)模豬群的PCV2抗體均具有一定的差異性，具體分析可見后面討論章節(jié)。

3 討論

用已建立的ELISA方法初步進行了送檢血清樣品的檢測，從檢測的結果來看，目前我國的豬群中廣泛存在PCV2的抗體，249份中175份呈陽性，陽性率達70.28%，這與臨床上PCR檢測PCV2核酸陽性率70.70%具有一定的相關性。

本試驗血清是隨機采樣的，涉及東臺不同類型的豬只包含了母豬、大豬、中豬、斷奶仔豬及哺乳仔豬，因而具有一定的代表性。

以上數(shù)據(jù)都充分說明：PCV2已在東臺地區(qū)豬群中普遍存在，并且感染嚴重。而我們知道東臺地區(qū)近年飼養(yǎng)的豬多為自繁自養(yǎng)或本地區(qū)種豬場相互引進，這說明東臺豬群至少在幾年前就已經(jīng)感染了PCV2，只是未引起注意和重視。不同區(qū)域豬群陽性率不同，不同養(yǎng)殖方式豬群陽性率不同。說明PCV2感染范圍廣之外還具有差異性，這與各地豬場豬群日齡的長短、飼養(yǎng)管理水平的高低、豬的營養(yǎng)狀況、機體的免疫力有關外，與豬場所處地理位置、區(qū)域特性、養(yǎng)殖環(huán)境以及交通狀況也有著不容忽視的影響：東南區(qū)域養(yǎng)殖場十分密集，一家緊靠一家，并且這種情況到處可見，同時東南區(qū)域又與南通地區(qū)的養(yǎng)殖大縣海安接壤，其養(yǎng)殖環(huán)境、疫病狀況就可想而知；東蹲線片區(qū)是著名乳豬生產(chǎn)之鄉(xiāng)，母豬則成為地方特色產(chǎn)業(yè)的根本保證和重要資源，而母豬的免疫向來一直是防疫的漏洞，也是一直比較令人頭疼的事情，PCV2感染當然在所難免，再加上母源抗體的垂直傳播使得哺乳仔豬陽性率居高不下；安梁富片區(qū)位于204國道沿線，運輸活畜及畜產(chǎn)品車輛眾多且進出頻繁，使得各種動物傳染病廣泛交叉?zhèn)鞑コ蔀榭赡?，所以這3個片區(qū)的豬群PCV2感染陽性率相對偏高也就不難理解了。母豬抗體陽性率92.86%，屠宰豬80.95%，中豬69%，斷奶仔豬56.67%中還可以看出PCV2抗體陽性率與豬的年齡有一定關系，是隨著豬年齡增長而升高的，原因是飼養(yǎng)日齡的增長而感染的機率大增。唯一不同的是本試驗中哺乳仔豬的抗體陽性率卻遠高于斷奶仔豬，究其原因最大可能是哺乳仔豬樣品血清采自于東蹲片區(qū)以及哺乳仔豬體內(nèi)留有高母源抗體。

本試驗中母豬和屠宰豬的陽性率最高。提示在生豬飼養(yǎng)、收購、運輸、屠宰等環(huán)節(jié)均要重視該病防治。任何環(huán)節(jié)都可能成豬場內(nèi)外圓環(huán)病毒的持續(xù)感染，大大增加疫情控制的難度。而且在今后很長時間內(nèi)會影響東臺地區(qū)的養(yǎng)豬生產(chǎn)，成為養(yǎng)豬發(fā)展的潛在威脅，應引起相關部門領導和養(yǎng)豬業(yè)者的高度重視。

我們要警惕“生豬高熱病”，據(jù)了解有些地區(qū)的疫情形勢仍十分嚴峻，即使在疫情初發(fā)地區(qū)，還有很多豬場不斷暴發(fā)，發(fā)病豬表現(xiàn)出體溫升高、皮膚發(fā)紅，并有呼吸道癥狀以及消化道癥狀，發(fā)病率和死亡率均很高。要充分認識PCV2與“高熱病”的關聯(lián)性，對PCV2進行了科學防控。實踐證明，可以降低生豬死亡率50%～60%。一旦發(fā)生PCV2尚無有效治療方案?？股刈⑸浜土己玫墓芾?，有助于解決繼發(fā)感染或并發(fā)感染。而本病的疫苗正處于試驗階段，控制本病只能采取綜合性防制措施：

（1）加強飼養(yǎng)管理，降低飼養(yǎng)密度，減少應激因素。（2）實行嚴格的進出制度，減少和其他病原的感染。（3）搞好環(huán)境衛(wèi)生消毒。（4）保證豬群的營養(yǎng)水平。（5）做好豬瘟、豬偽狂犬病、豬細小病毒病、豬繁殖與呼吸綜合征和豬喘氣病的疫苗接種工作。（6）做好豬群平時的藥物預防，控制細菌性繼發(fā)感染。（7）各職能管理部門加強生豬收購、運輸、屠宰管理。