劉艷華，楊大偉，郭桂芳，梁先明，段文龍

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

獸藥中的雜質(zhì)按理化性質(zhì)一般分為三類:有機雜質(zhì)、無機雜質(zhì)和殘留溶劑。有機雜質(zhì)包括工藝中引入的雜質(zhì)和降解產(chǎn)物，來源于生產(chǎn)工藝和/或貯存期間的降解，這類雜質(zhì)的化學結(jié)構(gòu)與活性成分的分子式類似或具淵源關(guān)系，故通常又稱之為有關(guān)物質(zhì)［1］。有關(guān)物質(zhì)的研究是獸藥研究的重要環(huán)節(jié)，貫穿于整個獸藥研究的始終。其是否能被全面準確地控制，直接關(guān)系到獸藥的質(zhì)量與安全性，雖有相關(guān)技術(shù)指導原則參考［1－4］，但限于我國獸藥研發(fā)水平和生產(chǎn)的現(xiàn)狀，有關(guān)物質(zhì)研究仍然是獸藥研發(fā)的薄弱環(huán)節(jié)，本文主要針對獸藥有關(guān)物質(zhì)研究中常見的問題進行分析，以資借鑒。

1 分析方法的選擇

分析方法的選擇直接關(guān)系到有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果的專屬性與準確性，因此，有關(guān)物質(zhì)研究的首要問題是根據(jù)主藥及有關(guān)物質(zhì)的理化性質(zhì)、化學結(jié)構(gòu)、有關(guān)物質(zhì)的控制要求等確定適宜的檢查方法，有效檢出獸藥中的有關(guān)物質(zhì)。

常用的檢查方法主要是薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)和氣相色譜法(GC)。TLC通常對有關(guān)物質(zhì)進行定性或半定量研究，可以用于沒有紫外吸收的有關(guān)物質(zhì);HPLC可對有關(guān)物質(zhì)進行定性或定量研究，適用于多種有關(guān)物質(zhì)，是目前普遍采用的方法;氣相色譜法主要用于檢查揮發(fā)性有關(guān)物質(zhì)。各種分析方法側(cè)重點不同，應用時采用不同原理的分析方法進行相互補充與驗證。

常見問題:(1)忽視檢查方法的比較、優(yōu)選研究。目前的新獸藥注冊嚴格意義上說均為仿制藥，檢查方法應與已上市產(chǎn)品質(zhì)量標準或者文獻報道的方法做對比研究。如采用HPLC方法進行鹽酸頭孢噻呋注射液的有關(guān)物質(zhì)檢查，國外同品種獸藥采用梯度洗脫，最大雜質(zhì)峰δ－2－反式肟，限量為3.0%，4－酮基頭孢噻呋、MW=537的未知物、δ－3－順式肟和其他雜質(zhì)的總限度為3.5%;國內(nèi)企業(yè)申報時采用等度洗脫，僅規(guī)定雜質(zhì)總限量為不得大于3.0%;未對單個雜質(zhì)進行定性研究。梯度洗脫確實存在基線漂移大、操作相對繁瑣的缺點，但其在較短時間內(nèi)檢查雜質(zhì)的極性范圍廣，并可改善峰形，提高靈敏度，比較適用于對多種極性不明的未知有關(guān)物質(zhì)進行檢測，因此企業(yè)申報時在無充分研究的基礎(chǔ)上直接采用等度洗脫，且不進行對比研究，可能會導致有關(guān)物質(zhì)的漏檢。(2)完全照搬國外同品種標準，未根據(jù)自身產(chǎn)品的特點進行針對性研究。如原料中有關(guān)物質(zhì)的產(chǎn)生與合成工藝密切相關(guān)，鹽酸沃尼妙林原料中有關(guān)物質(zhì)直接參照《歐洲藥典》6.0版進行檢查，未考察國內(nèi)外合成工藝不同可能導致的產(chǎn)品有關(guān)物質(zhì)不同;且不同儀器及色譜條件的波動，使雜質(zhì)的校正因子產(chǎn)生一定范圍的誤差［5］，但企業(yè)申報時未提交自研產(chǎn)品雜質(zhì)譜分析研究的相關(guān)資料，也未對相對響應因子進行相關(guān)驗證，無法對方法適用性進行判斷。

2 分析方法的驗證

有關(guān)物質(zhì)的方法驗證重點在于專屬性和靈敏度的驗證。專屬性系指在其他成分可能存在的條件下，采用的方法能正確測定出被測有關(guān)物質(zhì)的特性。檢測限是反映分析方法靈敏度的一個重要指標，要符合質(zhì)量標準中對有關(guān)物質(zhì)限度的要求，檢測限不得大于該有關(guān)物質(zhì)的報告限度。

方法驗證時要結(jié)合獸藥的化學結(jié)構(gòu)特點、制劑的處方工藝和降解途徑等進行研究，分析獸藥中潛在的有關(guān)物質(zhì)，具體方法有:(1)有關(guān)物質(zhì)可以獲得，如為已知的某中間體、副產(chǎn)物或降解產(chǎn)物，可在原料或制劑中加入一定量進行系統(tǒng)適用性研究，考察各有關(guān)物質(zhì)與主峰間的分離度是否符合要求，從而驗證分析方法對有關(guān)物質(zhì)的分離能力。(2)有關(guān)物質(zhì)不可以獲得，需要與已驗證或獸藥典收載的方法進行對比或破壞性試驗。破壞性試驗多采用酸、堿、光、熱、氧化反應等強制降解來驗證，在試驗過程中，應注意適度破壞，一般以破壞后主成分的含量占絕大部分為宜(80% ～90%)，要達到這種破壞程度，需要在研究過程中進行摸索，先通過初步試驗了解樣品對光、熱、酸、堿和氧化等的基本穩(wěn)定情況，然后再調(diào)整光照強度、酸堿濃度、破壞時間、溫度等試驗條件，常見的試驗條件為強光照射:4500 lx;高溫:較加速試驗溫度高10℃;酸水解:0.1～1 mol/L鹽酸或硫酸溶液;堿水解:0.1～1 mol/L氫氧化鈉溶液;氧化:3% ～5%過氧化氫溶液。注意并不是每種破壞條件下主藥必須降解，具體條件要結(jié)合獸藥的特點。

常見問題:(1)破壞程度不當。如非潑羅尼原料藥在酸、堿、氧化、光照、高溫等條件下進行破壞試驗，主藥含量分別為 99.08%、96.45%、99.44%、98.53%和99.43%，其新增有關(guān)物質(zhì)含量小，破壞程度不足，不能很好考察檢測方法的分離能力。如果破壞性條件過于劇烈，會產(chǎn)生一些在生產(chǎn)和貯存條件下不可能生成的二級甚至三級降解產(chǎn)物，對色譜條件的篩選不利。(2)未進行檢測波長的選擇，這是獸藥有關(guān)物質(zhì)研究中最常見的問題。優(yōu)化的檢測波長應是主要有關(guān)物質(zhì)的最大吸收，而不是主藥的最大吸收，同時，應使主藥和各主要有關(guān)物質(zhì)的響應差異最小，多采用二極管陣列檢測器(DAD)進行波長的選擇。(3)未考察主藥和有關(guān)物質(zhì)的物料平衡，即在主藥含量下降的同時，有關(guān)物質(zhì)增加了相應的失去量。如托芬那酸注射液穩(wěn)定性試驗中主藥含量下降約5%，但有關(guān)物質(zhì)均未檢出，在其提供的破壞性試驗資料中僅考察主峰與相鄰有關(guān)物質(zhì)峰的分離度，未對檢測波長選擇，未考察主峰與有關(guān)物質(zhì)的物料平衡，也未考察空白輔料在破壞性試驗條件下的影響，因此造成方法的不可行。(4)未提供方法的靈敏度或僅文字敘述而無任何數(shù)據(jù)和圖譜來進行證明。有的企業(yè)雖然提供了圖譜，但縱坐標過大，導致實際看到的為一水平直線，無從判斷檢測限是否符合信噪比大于3的要求，試驗結(jié)果的可信度不高。(5)未進行系統(tǒng)適用性試驗。HPLC色譜系統(tǒng)的適用性試驗通常包括理論板數(shù)、分離度、重復性和拖尾因子等四個指標。國外企業(yè)的內(nèi)控標準大多制訂指標的限度，在有關(guān)物質(zhì)不可獲得時，甚至通過破壞性試驗條件下的樣品來進行系統(tǒng)適用性試驗，國內(nèi)企業(yè)在研究時多未進行相應規(guī)定，因此會出現(xiàn)色譜圖中明顯的主峰拖尾仍進行試驗，分辨不出是樣品超載，還是主峰包含有關(guān)物質(zhì)峰造成的，分析方法不可信，結(jié)果不可靠。

3 定量方法的選擇

目前有關(guān)物質(zhì)的檢查多采用HPLC法，定量方法有:(1)有關(guān)物質(zhì)對照品法;(2)加校正因子的主成分自身對照法;(3)不加校正因子的主成分自身對照法;(4)峰面積歸一化法。方法1定量比較準確、定位方便，缺點是費用高、購買不到有關(guān)物質(zhì)對照品時需要提供對照品的制備和考核材料，是有條件時首選的方法。方法2需對校正因子進行嚴格的測定，僅適用于已知有關(guān)物質(zhì)的控制，定量比較準確，但定位較困難，需測定校正因子，適用于有關(guān)物質(zhì)和主成分響應因子差異大(有關(guān)物質(zhì)對主成分的相對響應因子在0.9～1.1范圍內(nèi)時可忽略校正因子)且對照品昂貴時首選的方法。方法3的前提是假定有關(guān)物質(zhì)與主成分的響應因子相同，適用于與主成分具有相同或類似發(fā)色基團的有關(guān)物質(zhì)，其費用低、不需定位，但定量準確度較差，是有關(guān)物質(zhì)對照品時首選的方法。方法4簡便快捷，但存在各有關(guān)物質(zhì)響應因子不一定相同、有關(guān)物質(zhì)量與主藥量不一定在同一線性范圍內(nèi)、儀器對微量有關(guān)物質(zhì)和常量主藥的積分精度及準確度不相同等因素，雖然費用低、不需定位，但定量準確性較差、影響因素多、結(jié)果重復性差，一般不提倡使用。

常見問題:(1)未提供采用峰面積歸一化法的理由。雖有文獻報道［6］隨著現(xiàn)代液相色譜儀性能的提高，儀器的線性范圍一般可達3個數(shù)量級以上，實際檢測時一般不會超出線性范圍，因此歸一化法和不加校正因子的主成分自身對照法所得結(jié)果往往基本一致。但獸藥企業(yè)在申報時并未考慮有關(guān)物質(zhì)和主藥的含量是否在儀器的線性范圍內(nèi)，并且采用面積歸一化法時，為防止主藥峰面積太大，進樣量少，有關(guān)物質(zhì)峰可能較小，其峰面積測定值的相對誤差就會較大，理論上講可能造成面積歸一化法誤差偏大，因此該方法不推薦用于微量有關(guān)物質(zhì)的檢查。(2)未提供定量時的積分參數(shù)，起草說明、標準中也未提供最小峰面積的閾值?！队幍洹?2011年版)對有關(guān)物質(zhì)規(guī)定有報告限度或最小峰面積閾值，《中國獸藥典》(2010年版)和《中國藥典》(2010年版)目前對此無強制要求，僅部分品種對此有規(guī)定，但實際檢測時，最小峰面積設(shè)定的大小，直接會影響到有關(guān)物質(zhì)含量的測定值，其參數(shù)設(shè)定得越大，有關(guān)物質(zhì)峰越不容易被積分出來，有關(guān)物質(zhì)含量相對容易合格，對有關(guān)物質(zhì)含量處于邊緣時，容易產(chǎn)生檢驗結(jié)論的分歧，因此建議企業(yè)在標準中對此進行規(guī)定，避免申報材料中出現(xiàn)明明有峰卻不進行積分的現(xiàn)象。

4 限度的制訂

有關(guān)物質(zhì)限度的確定首先考慮安全性，尤其是有藥理作用或毒性的有關(guān)物質(zhì);其次考慮生產(chǎn)的可行性及批與批之間的正常波動;還要考慮獸藥本身的穩(wěn)定性。

對于創(chuàng)新獸藥，可直接用分離純化的有關(guān)物質(zhì)進行安全性研究，也可采用含有一定種類與數(shù)量有關(guān)物質(zhì)的樣品進行一系列藥理毒理及臨床研究來驗證獸藥的安全有效性。如果在這些研究中并未明顯反映與有關(guān)物質(zhì)有關(guān)的毒副作用，即使有關(guān)物質(zhì)的含量超出指導原則［1］的報告限度，從安全性方面考慮，也可認為該有關(guān)物質(zhì)的含量已經(jīng)過了安全性的驗證。如有關(guān)物質(zhì)是該藥物在動物中的主要代謝產(chǎn)物，則對該有關(guān)物質(zhì)可不考慮其安全性，但需制訂合理的限度。

對于已有國家標準的獸藥，可以根據(jù)已有的標準制訂相應的有關(guān)物質(zhì)限度。如果該標準中未規(guī)定有關(guān)物質(zhì)的限度，應與已上市同品種獸藥進行全面的質(zhì)量對比研究，根據(jù)質(zhì)量對比研究的結(jié)果，以及穩(wěn)定性考察的結(jié)果，決定是否在質(zhì)量標準中對有關(guān)物質(zhì)進行控制并制定相應的限度。由于工藝或處方的不同導致在研產(chǎn)品與已上市同品種產(chǎn)品的有關(guān)物質(zhì)種類不同，若限度超過規(guī)定的合理限度，為了保證產(chǎn)品的安全性，應考慮優(yōu)化產(chǎn)品的處方與制備工藝，將有關(guān)物質(zhì)的含量降到規(guī)定的限度以內(nèi)。如仍達不到要求，則應做必要的安全性研究。

常見問題:(1)藥理毒理和臨床研究用樣品中有關(guān)物質(zhì)含量過低。一般而言，按照毒理研究樣品、臨床研究樣品和上市產(chǎn)品的順序，其中的有關(guān)物質(zhì)含量應依次遞減，毒理研究用樣品中的有關(guān)物質(zhì)含量應該最高［7］。在毒性試驗可接受的前提下，只要臨床使用獸藥中有關(guān)物質(zhì)的含量小于毒性試驗中有關(guān)物質(zhì)的含量，就可認為有關(guān)物質(zhì)的安全性已經(jīng)通過評價。目前企業(yè)提交資料中往往是藥理毒理研究樣品和臨床研究樣品相同，穩(wěn)定性考察試驗樣品中有關(guān)物質(zhì)含量較藥理毒理試驗樣品中有關(guān)物質(zhì)含量低，如米爾貝肟原料藥藥理毒理所用樣品的含量均≥98%，但該原料藥在長期穩(wěn)定性考察時1個批次0個月的有關(guān)物質(zhì)檢測數(shù)據(jù)為2.20%，所制訂有關(guān)物質(zhì)限度為3.0%，其安全性風險就得不到有效的控制。(2)對超過有關(guān)物質(zhì)相應限度的樣品未按相關(guān)指導原則進行研究。如規(guī)定獸醫(yī)專用制劑中雜質(zhì)鑒定限度為1.0%，那么高于此限度的雜質(zhì)就應進行定性分析，確定其化學結(jié)構(gòu)。但從申報資料的提交上看，目前多數(shù)企業(yè)未進行此類研究，因此企業(yè)在研發(fā)獸藥時，務(wù)必熟悉指導原則的有關(guān)規(guī)定，在研究的完整性和規(guī)范性上符合要求。

隨著對有關(guān)物質(zhì)認識的深入、檢測手段的發(fā)展，對有關(guān)物質(zhì)的技術(shù)要求也在不斷提高，企業(yè)應重視獸藥研發(fā)中的有關(guān)物質(zhì)研究，通過系統(tǒng)全面的研究，在不影響獸藥療效、不發(fā)生與有關(guān)物質(zhì)相關(guān)的毒副反應的前提下，將有關(guān)物質(zhì)控制在一個安全、合理的范圍內(nèi)，以切實保證獸藥的質(zhì)量和安全。

［1］農(nóng)業(yè)部公告第630號.獸用化學藥物雜質(zhì)研究技術(shù)指導原則［S］.

［2］中國獸藥典委員會.獸藥雜質(zhì)分析指導原則［S］.中華人民共和國獸藥典附錄二〇一〇年版.

［3］VICH GL10:Impurities in new veterinary drug substances［EB/OL］.(2008 － 01)http://www.www.vichsec.org/pdf/2000/GL10_ST7(R).pdf

［4］VICH GL11:Impurities in new veterinary medicinal products［EB/OL］.(2008 － 01)http://www.www.vichsec.org/pdf/2000/GL11_ST7(R).pdf

［5］張哲峰.HPLC法檢測有關(guān)物質(zhì)中校正因子研究與使用中的幾點考慮［J/OL］.藥品技術(shù)審評論壇，2011(4).(2011－12 － 07)http://www.cde.org.cn/dzkw.do?method=largePage＆id=312552

［6］張啟明，李慧義.色譜分析中面積歸一化法測定有關(guān)物質(zhì)的弊與利［J］.中國藥品標準，2005，6(4):45 －46.

［7］陳 震.有關(guān)物質(zhì)的研究與新藥注冊［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2010，41(11):872－876.