王建龍 李海濤 蘇丕雄 顧 松 劉 巖 張希濤 顏 鈞 安向光

高 杰2 辛 悅2 蔡 軍2*

(1.北京市普仁醫(yī)院心內(nèi)科，北京100062;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院心臟中心，北京100020)

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要機(jī)制之一。DNA甲基化與生長、發(fā)育等生命活動及腫瘤等疾病的形成息息相關(guān)。目前DNA甲基化在腫瘤發(fā)生中的作用仍是研究的一個熱點，而關(guān)于其在心血管疾病發(fā)生過程中作用的研究則剛剛起步［1］。本實驗用甲基化芯片篩選的方法分析心衰心肌標(biāo)本和正常心肌標(biāo)本中DNA甲基化的差異。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1)主要試劑：dNTP-mix購自美國Invitrogen公司; Platinum-DNA-Polymerase購自美國 Invitrogen公司;Invitrogen凝膠回收試劑盒購自美國Invitrogen公司; DNA ladder購自美國 Invitrogen公司;MethylCodeTMBisulfite Conversion Kit購自美國Invitrogen公司;EZ DNA Methylation-Gold Kit購自美國ZYMO Research公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒購自美國 Axygen公司; pMD18-T購自寶生物(大連)有限公司;Takara Total-Prep RNA擴(kuò)增試劑盒購自美國Illumia公司。

2)主要儀器：離心機(jī)(5810R/5415D)購自美國Eppendorf公司;PCR儀購自美國ABI公司;電泳儀購自美國 Bio-Rad公司;Infinium HumanMethylation27 BeadChip購自美國Illumina公司;HumanHT-12 v4 Expression BeadChip購自美國Illumina公司;實時熒光定量PCR儀(48孔)(TC988型)購自沈陽永鑫益實驗儀器銷售有限公司;Illumina BeadChip Reader掃描儀(HiScanSQ)購自美國Illumina公司;RNase-Free凍存管購自美國Corning公司;海爾－80℃冰箱 (DW-86L386)購自青島海爾公司。

3)實驗材料：選取2008年至2009年首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院心臟外科收治的心臟移植患者作為研究對象，本實驗分正常對照組和疾病組，其中正常組8例取自心臟移植供體左心室心肌，疾病組14例均取自心臟移植患者自身心臟左心房心肌。所有標(biāo)本采樣時液氮中速凍后保存于 －80℃ 冰箱中，并使用液氮運輸。該實驗通過相關(guān)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 試驗方法

1)DNA甲基化芯片高通量篩選：用美國EZ DNA Methylation Kit將DNA中未甲基化CG島的C轉(zhuǎn)化為T?；蚪MDNA經(jīng)NaOH變性后，加入含引物的MA2 (multi sample amplification 2 Mix)和含酶的MSM(multi sample amplification master Mix)擴(kuò)增。擴(kuò)增好的DNA中加入FMS(fragmentation solution)，37℃酶切1 h。加入含鹽分溶液PM1和異丙醇，使片段化的DNA沉淀。加入含對照DNA的RA1于48℃放置1 h，使其充分懸浮后加到芯片(Infinium Human Methylation27 Bead Chip)上，48℃雜交16 h～24 h。洗去未雜交的和非特異雜交的DNA并組裝雜交艙。以雜交在芯片上的DNA為模板，加入TEM(含SBE酶，biotin-dNTP，DNP)和95%甲酰胺/1 mmol·L－1EDTA，去除目標(biāo)DNA，芯片上僅留微珠上的單鏈探針。染色。使用掃描儀通過雙色激光激發(fā)微珠上的熒光基團(tuán)，掃描得到雜交信號，采用軟件自動分析給出代表甲基化程度的Beta值。

2)mRNA表達(dá)譜芯片高通量篩選：取RNA樣本加入無RNA酶的水至11 μL，之后與反轉(zhuǎn)錄母液9 μL混合42℃孵育2 h合成第一鏈cDNA，繼續(xù)添加第二鏈反應(yīng)母液80 μL，混合后16℃孵育2 h合成第二鏈cDNA;繼之每個樣本中加入250 μL cDNA結(jié)合液，cDNA慮柱濾過，用500 μL洗脫液洗滌，用19 μL 50℃ ～55℃無RNA酶液洗脫cDNA完成cDNA純化;體外轉(zhuǎn)錄cDNA后cRNA純化。RNA擴(kuò)增所用試劑為Illumia TotalPrep RNA擴(kuò)增試劑盒。純化后的cRNA與芯片雜交干燥后采用掃描儀掃描完成圖像分析。

3)重亞硫酸鹽測序：22個基因組DNA樣品各取約500 ng，用MethylCode Bisulfite Conversion Kit(Invitrogen)對基因組DNA進(jìn)行甲基化處理。用合成好的引物和處理過的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。凝膠回收PCR產(chǎn)物。將回收的PCR產(chǎn)物與 pMD18-T (Takara)連接，室溫連接2 h。取5 μL連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化100 μL DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂氨芐平板，37℃過夜孵育。每個平板挑5個克隆接種于3 mL LB中，37℃過夜培養(yǎng)。用質(zhì)粒小量提取試劑盒(Axygen)提取質(zhì)粒。對質(zhì)粒進(jìn)行測序，并分析測序結(jié)果。

4)定量反轉(zhuǎn)錄PCR(定量RT-PCR)驗證：提取總RNA，制備反轉(zhuǎn)錄酶混合反應(yīng)液其總體積20 μL。在PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)：16℃，30 min;42℃，42 min;85℃，5 min。反應(yīng)結(jié)束后，將其放在－20℃保存。將所有cDNA樣品分別配置Real time PCR反應(yīng)體系。置于實時PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，繪制熔解曲線，每一個mRNA的相對表達(dá)水平通過與內(nèi)參(U6)對比進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并根據(jù)熒光曲線圖計算樣本Ct值。abca4的引物序列：5'-GAATCCTACATTACAGCGACCC-3'，3'-GTGGCAGGTAGAGGGTGAAAT-5';cd200的引物序列：5'-GTCTACCTACAGCCTGGTTTGG-3'，3'-AAGGTGATGGTTGAGTTTTGGA-5'。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

本實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 16.0版本統(tǒng)計學(xué)分析軟件進(jìn)行分析，亞硫酸氫鈉測序PCR測序分析和熒光定量PCR驗證分析結(jié)果均采用獨立樣本t檢驗檢測，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

本組實驗將正常組與疾病組芯片上甲基化探針的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，利用t檢驗計算差異是否有統(tǒng)計學(xué)意義，將P值經(jīng)取對數(shù)等處理后命名為DiffScore，按照Diffscore值＞20或＜－20的差異甲基化水平比較篩選2組的基因，共得到差異甲基化基因871條，其中甲基化程度升高的基因位點有352個，甲基化程度低的基因位點有519個。結(jié)果詳見圖1。

圖1 人類心力衰竭患者23對染色體DNA甲基化芯片分析結(jié)果Fig.1 Results of whole genome methylation in heart failure patientsRed part：high methylation locus;Blue part：low methylation locus;.Green part：chromosomal centromere locus.

將差異甲基化對應(yīng)的基因與mRNA表達(dá)譜分析得到的差異基因取交集，共得到13條基因，詳見表1。

表1 疾病組與正常組差異甲基化與差異基因Tab.1 Differential methylation gene

選取abca4和cd200進(jìn)行亞硫酸氫鈉測序PCR (bisulfite sequencing PCR，BS-PCR)，并用熒光定量PCR驗證對應(yīng)基因表達(dá)量的改變。疾病組abca4基因啟動子區(qū)甲基化率為85.5%，正常組基因啟動子區(qū)甲基化率為91.2%(圖2);疾病組基因啟動子區(qū)甲基化率比正常組基因啟動子區(qū)甲基化率低5.7%，疾病組cd200基因啟動子區(qū)甲基化率為50.5%，正常組基因啟動子區(qū)甲基化率為57.1%。

3 討論

DNA甲基化是通過將S2腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，并在 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化下，CpG二核苷酸中的胞嘧啶環(huán)上5'位置的氫被活性甲基所取代，從而轉(zhuǎn)變成52甲基胞嘧啶。DNA甲基化具有多方面的生理意義，正常的甲基化對于維持機(jī)體的功能是必需的，如基因印記、X染色體失活、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育等［2］。DNA甲基化異常包括基因組DNA甲基化水平降低和局部CpG島甲基化程度升高，即低甲基化和高甲基化。DNA甲基化異常主要指DNA高甲基化［3］。一般情況下，基因啟動子區(qū)的CpG島為非甲基化狀態(tài)，當(dāng)發(fā)生甲基化時，常導(dǎo)致基因表達(dá)減少或缺失。特定基因啟動子區(qū)的異常高甲基化往往與腫瘤的形成和發(fā)展有關(guān)［2］。而癌基因低甲基化則會使相關(guān)基因高表達(dá)從而造成正常細(xì)胞生長分化調(diào)控失常［4-5］。而導(dǎo)致這些基因表達(dá)量改變的DNA甲基化的變化可能很輕微。有研究［6］顯示小腦和大腦組織中rassf1基因甲基化6%的差異會導(dǎo)致基因表達(dá)量不同。Barrès R等［4］也報道pgc1a基因啟動子區(qū)甲基化2% ～5%的不同會導(dǎo)致Ⅱ型糖尿病人股外側(cè)肌中pgc1α基因表達(dá)量3.5倍的差異。乳腺癌患者中，atm基因甲基化8%的不同導(dǎo)致基因表達(dá)量1.5～3.5倍的差異［5］。

Movassagh M等［1］研究認(rèn)為心力衰竭時同樣存在著DNA甲基化的異常，并且他們發(fā)現(xiàn)不同的甲基化狀態(tài)對應(yīng)著基因的不同表達(dá)，pecam1基因5'區(qū)高甲基化基因本身則低表達(dá);arhgap24基因的高甲基化其本身則高表達(dá)，而amotl2基因的低甲基化其本身則低表達(dá)，這可能與心力衰竭發(fā)生過程的細(xì)胞凋亡、鈣離子信號失調(diào)，及心肌收縮異常、G蛋白受體表達(dá)下調(diào)和血管發(fā)生過程異常等病理過程有關(guān)。本課題組應(yīng)用甲基化的方法高通量篩選心力衰竭組與正常對照組的基因組甲基化異常并與基因表達(dá)譜芯片篩選的疾病組和對照組間的差異基因取交集得到了13條異常的基因，選取abc4和cd200進(jìn)行研究，從功能分析，abca4基因?qū)儆谀まD(zhuǎn)運蛋白ATP-結(jié)合盒(ATP-binding cassette，ABC)家族轉(zhuǎn)運體中A族的第4個成員，由47個外顯子組成，基因位于染色體1p22上，該基因表達(dá)產(chǎn)物可能參與觀光細(xì)胞中一種特殊分子的跨膜轉(zhuǎn)運［7］。有研究［8］顯示，在眼底黃色斑點癥患者中存在abca4基因突變。同時，這一突變可能與視網(wǎng)膜色素變性19基因［9］(retinitis pigmentosa-19)和老年黃斑變性2基因［10-13］(macular degeneration age-related 2)有關(guān)。但是，目前認(rèn)為abca4基因僅在視網(wǎng)膜感光細(xì)胞中表達(dá)，尚未在心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)abca4基因的編碼蛋白［14］。cd200基因編碼蛋白是一種Ⅰ-型膜糖蛋白，由6個外顯子組成，基因位于染色體3q12-q13上［15］，胞膜外區(qū)有兩個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，屬于免疫球蛋白超家族，廣泛地表達(dá)在組織中［16］，在多種B細(xì)胞來源的血液腫瘤中高表達(dá)［17］，并與雄激素性脫發(fā)患者毛囊細(xì)胞成熟過程有關(guān)［18］。cd200具有介導(dǎo)T細(xì)胞共刺激信號、促進(jìn)T細(xì)胞增生、使Ⅰ-型細(xì)胞因子減少、2型細(xì)胞因子增加的作用。cd200蛋白在免疫疾病、抑制排斥反應(yīng)及腫瘤生長過程中作為一種免疫耐受信號［15］，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用［19］。

總之，本課題組的研究表明心衰時DNA啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)會發(fā)生改變，本課題組的研究只是初步揭示了DNA甲基化在心力衰竭時的改變，而DNA甲基化究竟如何在心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展過程中起作用，及究竟哪些基因位點發(fā)生了甲基化目前還不清楚，尚待期待著進(jìn)一步的研究來揭示這一奧秘。

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