程惠娟，汪長中，胡躍龍，盧文波，高磊，李露天

(安徽中醫(yī)學(xué)院，安徽合肥230038)

銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa是呼吸道重要的生物被膜菌，生物被膜菌最顯著的特征是高度的耐藥性。因此，常引起難治性呼吸道生物被膜病。尋找抗細(xì)菌生物膜的藥物，防治細(xì)菌生物膜病已成為全球關(guān)注的重大難題，是目前研究的前沿和熱點(diǎn)。中藥有效成分魚腥草素鈉在臨床治療慢性支氣管炎及其他上呼吸道感染性疾病中有較好療效，其機(jī)理未明。本課題研究魚腥草素鈉對(duì)銅綠假單胞菌早期生物被膜及成熟期生物被膜的清除作用，以進(jìn)一步闡明魚腥草素鈉的療效機(jī)制，為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料

1.1 菌株和藥物標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853(中國藥品生物制品檢定所)，魚腥草素鈉標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所批號(hào)100247－199601)。

1.2 主要試劑和儀器LB培養(yǎng)基、胰酶大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB，杭州微生物試劑有限公司);四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma公司);二甲基亞砜(DMSO，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，分析純);自配pH7.4的PBS溶液。318酶標(biāo)儀(上海三科儀器有限公司);96孔微量培養(yǎng)板(杭州生友生物技術(shù)有限公司);DPH—9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司);CX21型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司);Sirion200型場掃描電鏡(美國FEI公司)。

2 方法

2.1 銅綠假單胞菌生物被膜形成的觀察挑選過夜培養(yǎng)的菌落4個(gè)接種于LB肉湯培養(yǎng)基中37℃孵育6 h，培養(yǎng)液經(jīng)離心、無菌生理鹽水洗滌后，比濁到0.5麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)(1.5×108cfu/mL)，再經(jīng)TSB液體培養(yǎng)基稀釋200倍加入到96孔平底微量培養(yǎng)板每孔200 μL，37℃孵育。根據(jù)Sauer K等［1］報(bào)道，設(shè)3 d、7 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，作為早期生物被膜階段、成熟期生物被膜階段的觀察，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)4個(gè)復(fù)孔，并設(shè)不含菌培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，每隔24 h棄培養(yǎng)基，用PBS清洗浮游菌，重新加入新鮮培養(yǎng)基。各時(shí)間點(diǎn)取出培養(yǎng)板，MTT法，即50 μL的MTT溶液(貯存液含5 mg/mL PBS，臨用前用預(yù)溫的0.15 mol/L PBS按1∶5稀釋)加入每孔中，37℃孵育5 h。棄去含MTT的培養(yǎng)基，PBS洗3遍，加入DMSO 100 μL，振蕩5 min，在酶標(biāo)儀492 nm波長下檢測吸光度。

2.2 魚腥草素鈉對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜的清除作用菌液制備同生物被膜形成的觀察。將菌液加入到96孔平底微量培養(yǎng)板1～11列各孔中，每孔100 μL，37℃孵育3 d、7 d作為早期生物被膜和成熟期生物被膜的清除作用觀察。到觀察時(shí)間點(diǎn)后棄去培養(yǎng)液，用PBS多次清洗未吸附菌。魚腥草素鈉經(jīng)吐溫80和甘油溶解后，用TSB液體培養(yǎng)基對(duì)倍稀釋10個(gè)最終質(zhì)量濃度500、250、125、62.5、31.25、15.6、7.8、3.9、1.95、0.98 mg/L，各質(zhì)量濃度分別加入1～10列孔中，每孔100 μL，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，11、12列各孔中加入不含藥培養(yǎng)基，分別作為陰性和培養(yǎng)基對(duì)照。給藥1 d后，MTT法，在酶標(biāo)儀492 nm波長下檢測吸光度，吸光度在陰性對(duì)照孔50%為SMEC50。

2.3 魚腥草素鈉對(duì)受試菌生物被膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)影響蓋玻片經(jīng)高壓滅菌后置入無菌6孔平底培養(yǎng)板中每孔1片，加入2 mL TSB培養(yǎng)基，將200 μL的1×104cfu/mL銅綠假單胞菌的菌體混懸液加入六孔板中，37℃孵育3 d、7 d作為早期生物被膜和成熟期生物被膜的清除作用的形態(tài)觀察，同時(shí)設(shè)不加藥物的陰性對(duì)照組，在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出蓋玻片用15 mL PBS 3次充分清洗后重新置入6孔平底培養(yǎng)板中，實(shí)驗(yàn)組加入2 mL含藥物質(zhì)量濃度為250 mg/L TSB液體培養(yǎng)基，陰性對(duì)照組加不含藥培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)孵育24 h后取出蓋玻片，PBS清洗后鍍銀染色，掃描電鏡下觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

2.4 數(shù)據(jù)處理采用SPSS11.0 for Windows軟件處理，用兩獨(dú)立樣本方差分析對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以均數(shù)(x±s)表示。

3 結(jié)果

3.1 銅綠假單胞菌生物被膜形成的過程見圖1。

從圖1觀察到細(xì)菌培養(yǎng)3 d形成早期生物被膜，在這過程中生物被膜產(chǎn)量最高，從早期到成熟生物被膜過程中生物被膜僅有少量增多。

3.2 魚腥草素鈉對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜的清除作用見圖2、圖3。圖2、圖3顯示魚腥草素鈉同樣藥物質(zhì)量濃度對(duì)早期生物被膜的作用強(qiáng)于成熟生物被膜，清除作用隨藥物質(zhì)量濃度增加而加強(qiáng)。SMEC50早期生物被膜為15.6 mg/L、成熟期生物被膜為250 mg/L，與對(duì)照組相比差異顯著，P=0.01和P=0.000，早期生物被膜發(fā)展到成熟生物被膜過程中SMEC50都為250 mg/L。見圖4。

圖1 銅綠假單胞菌生物被膜形成的動(dòng)態(tài)過程(n=4，±s)Fig.1 Dynam ic process of Psedomonas aeruginosa biofilm formation(n=4，±s)

圖2 各質(zhì)量濃度魚腥草素鈉對(duì)銅綠假單胞菌早期生物被膜作用的比較(n=4，±s)Fig.2 Com parison of different houttuyfonate sodium concentrations on eradicating initial Psedomonas aeruginosa biofilm s(n=4，±s)

圖3 各質(zhì)量濃度魚腥草素鈉對(duì)銅綠假單胞菌成熟期生物被膜作用的比較(n=4，±s)Fig.3 Com parison of different houttuyfonate sodium concentrations on eradicating mature Psedomonas aeruginosa biofilms(n=4，±s)

3.3 魚腥草素鈉對(duì)受試菌生物被膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)影響見圖5。

圖4 魚腥草素鈉對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜形成各階段SMEC50Fig.4 MEC50 of houttuyfonate sodium for Psedomonas aeruginosa biofilms formed at different phases

圖5 掃描電鏡下觀察魚腥草素清除銅綠假單胞菌生物被膜的作用(×10 000)Fig.5 Effects of houttuyfonate sodium d on eradicating Psedomonas aeruginosa biofilms observed by SEM(×10 000)

掃描電鏡下觀察到銅綠假單胞菌早期的生物被膜，由密集的胞外基質(zhì)形成黏液層，大部分細(xì)菌已被包裹在有胞外基質(zhì)形成的黏液層下，少量細(xì)菌鑲嵌在黏液層之間，成熟期的生物被膜黏液層明顯增厚如蘑菇狀形態(tài)，其內(nèi)部有相互交織的孔道，細(xì)菌被胞外基質(zhì)完全覆蓋。而由250 mg/L藥物質(zhì)量濃度作用過的載體，早期生物被膜形成階段和成熟生物被膜階段，均未觀察到明顯的生物被膜結(jié)構(gòu)，僅見載體上存在散在的黏液，分布著少量的細(xì)菌，早期生物被膜階段的細(xì)菌菌體光滑，成熟期生物被膜階段的細(xì)菌，菌體表面較粗糙，藥物作用過的載體上細(xì)菌形態(tài)發(fā)生變異，由桿狀變成球桿狀。

4 討論

魚腥草素鈉是天然植物三白草蕺菜屬植物魚腥草的主要有效成分和亞硫酸氫鈉加成物，具有消腫，抗化膿感染的功效。以往的研究只表明該藥僅具微弱的抗菌作用，據(jù)臨床報(bào)道治療呼吸道肺系疾病有很好的療效［2－5］。本研究發(fā)現(xiàn)，魚腥草素鈉對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜有清除作用。銅綠假單胞菌是最典型的生物被膜菌，實(shí)驗(yàn)中觀察到銅綠假單胞菌在建立早期生物被膜過程中生物被膜產(chǎn)量顯著增多，從早期生物被膜發(fā)育到成熟生物被膜過程中膜產(chǎn)量增加不顯著。從理論上分析細(xì)菌在生物被膜形成前生長代謝活躍，當(dāng)被生物膜包裹后就進(jìn)入休眠期，因此產(chǎn)膜也不活躍，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和理論分析一致。掃描電鏡下生物被膜形態(tài)觀察可印證此過程，早期生物被膜由胞外基質(zhì)形成膜狀結(jié)構(gòu)，成熟期的生物被膜表現(xiàn)為膜的增厚，該結(jié)果與Sauer K等［1］報(bào)道相符。魚腥草素鈉對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜的清除實(shí)驗(yàn)中，分別在形成早期生物被膜和成熟期生物被膜后藥物作用24 h測定生物被膜的清除作用，SMEC50早期生物被膜15 mg/L、成熟生物被膜250 mg/L，魚腥草素鈉的銅綠假單胞菌的早期生物被膜清除作用明顯強(qiáng)于對(duì)成熟期的生物被膜的清除作用，從圖1和圖5觀察分析與銅綠假單胞菌生物被膜的產(chǎn)量有關(guān)，隨著生物被膜產(chǎn)量的增多，SMEC50也隨之增大。這提示臨床治療相關(guān)感染應(yīng)該早期用藥，早期用藥可能有預(yù)防和消除生物被膜病的療效。

自然界大部分細(xì)菌以生物被膜狀態(tài)存在，生物被膜是由細(xì)菌通過產(chǎn)生多糖、蛋白質(zhì)、脂類、DNA組成胞外基質(zhì)形成，細(xì)菌將自己包裹在膜內(nèi)［6］。生物被膜很難清除［7－8］，人類80%的感染由生物被膜引起［9］。生物被膜基質(zhì)阻隔了免疫細(xì)胞和抗體的作用［10－11］。膜內(nèi)細(xì)菌因得不到充分的營養(yǎng)，代謝降低導(dǎo)致對(duì)大多數(shù)抗生素的不敏感［12］，吸附在生物被膜表面的細(xì)菌相對(duì)于其浮游狀態(tài)對(duì)抗生素的耐受性更強(qiáng)［12］。目前常規(guī)應(yīng)用的抗生素只能殺滅浮游菌，膜內(nèi)菌得到生物被膜的屏障保護(hù)而長期存活，釋放時(shí)又會(huì)引起新的感染，從而使感染反復(fù)發(fā)作。因此，以生物被膜為靶向的治療是解決生物被膜菌引起的慢性感染重要的策略。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，魚腥草素鈉的臨床療效與其抗生物被膜的作用有關(guān)，生物被膜的屏障作用被消除后可增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性以及免疫因素對(duì)細(xì)菌的清除。已有報(bào)道14元環(huán)或15元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素有一定的抗生物被膜作用［13］，但是長期應(yīng)用抗生素會(huì)引起新的臨床問題。魚腥草是藥食兩用的天然植物，具有長期服用對(duì)人體無毒副作用，不形成耐藥兩大優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)顯示魚腥草素鈉的抗生物被膜作用，表明其在抗感染治療中有良好的前景。

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