2種保和制劑中齊墩果酸、熊果酸和橙皮苷定量測(cè)定及比較分析

楊紅，劉亞蓉

(1.山西藥科職業(yè)學(xué)院，山西太原030031;2.青海省食品藥品檢驗(yàn)所，青海西寧810016)

保和丸始載于《丹溪心法》，是自金元時(shí)期記載以來沿用至今的傳統(tǒng)中藥名方。處方組成:山楂(焦)、六神曲(炒)、半夏(制)、茯苓、陳皮、連翹、萊菔子(炒)、麥芽(炒)。主要功效消食，導(dǎo)滯，和胃。用于食積停滯，脘腹脹滿，噯腐吞酸，不欲飲食。劑型有大蜜丸、水丸、濃縮丸、片劑、顆粒劑等。其中大蜜丸、水丸為傳統(tǒng)劑型，全部藥材粉碎直接入藥，臨床上也以大蜜丸、水丸為主，二者市場(chǎng)占有量達(dá)到全部保和制劑的60%以上。

大蜜丸、水丸收載于《中國(guó)藥典》2010年版一部，標(biāo)準(zhǔn)中將橙皮苷作為定量控制指標(biāo)［1］。本品處方中山楂為君藥，占處方量的37.5%，為原粉直接入藥，本實(shí)驗(yàn)參考有關(guān)文獻(xiàn)［2-4］選擇山楂中所含齊墩果酸、熊果酸作為指標(biāo)，對(duì)保和大蜜丸、水丸中山楂進(jìn)行定量控制，為更全面控制保和大蜜丸、水丸質(zhì)量提供了依據(jù)。同時(shí)對(duì)所收集到的6家大蜜丸生產(chǎn)企業(yè)的35批樣品、4家水丸生產(chǎn)企業(yè)的11批樣品按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行了橙皮苷的測(cè)定及比較，按本文方法進(jìn)行了齊墩果酸、熊果酸的測(cè)定和比較分析，為保和大蜜丸、水丸的質(zhì)量監(jiān)管提供了依據(jù)。

1 儀器和試藥

1.1 儀器Waters2695高效液相色譜儀，2487二極管陣列檢測(cè)器;Milli—QA超純水器(Millipore)。

1.2 試藥乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。熊果酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110742-200415，供定量測(cè)定用);齊墩果酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110709-200304，供定量測(cè)定用);橙皮苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110721-200512，供定量測(cè)定用);樣品(6家大蜜丸生產(chǎn)企業(yè)的35批樣品、4家水丸生產(chǎn)企業(yè)的11批樣品);陰性藥材購(gòu)自青海九康藥業(yè)有限公司，陰性樣品分別按照大蜜丸、水丸按原標(biāo)準(zhǔn)制備工藝去除焦山楂后制得。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)SunFireTMC18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.5%醋酸銨(5∶66∶29)，柱溫30℃，體積流量0.9 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。理論板數(shù)按熊果酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取齊墩果酸29.4 mg、熊果酸對(duì)照品29.2 mg，分別置100 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL各含齊墩果酸0.294 mg、熊果酸0.292 mg的對(duì)照品貯備液，精密量取齊墩果酸對(duì)照品溶液2 mL、熊果酸對(duì)照品溶液2 mL置10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液(每1 mL含齊墩果酸58.8 μg、熊果酸58.4 μg)。

2.2.2 供試品溶液制備

大蜜丸取大蜜丸約5 g，精密稱定，加硅藻土適量，研細(xì)后置索氏提取器中，加入乙醚適量，回流提取4 h，乙醚蒸干，殘?jiān)眉状?三氯甲烷(5∶1)混合溶液溶解并定容于10 mL量瓶中，微孔濾膜過濾，制得供試品溶液。

水丸取水丸細(xì)粉約2.5 g，精密稱定，加入乙醚適量，索氏提取器中回流4 h，乙醚蒸干，殘?jiān)眉状?三氯甲烷(5∶1)混合溶液溶解并定容于10 mL量瓶中，微孔濾膜過濾，制得供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備按處方比例稱取藥材(除焦山楂)適量，分別按照大蜜丸、水丸樣品生產(chǎn)工藝制得大蜜丸和水丸的陰性樣品。再依照保和丸供試品溶液的制備方法，分別制成大蜜丸、水丸的陰性對(duì)照溶液。在上述色譜條件下，精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液各5 μL，分別注入液色譜儀。供試品色譜圖中，在與兩種對(duì)照品色譜圖相應(yīng)保留時(shí)間上，與對(duì)照品有相同的色譜峰，分離度大于1.5，陰性對(duì)照在此無干擾，見圖1、2。

圖1 保和丸(大蜜丸)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of Baohe Big Honeyed Pills

圖2 保和丸(水丸)HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of Bohe W atered Pills

2.3 線性關(guān)系考察分別精密量取上述已配制好的齊墩果酸(質(zhì)量濃度為0.294 mg/mL)、熊果酸(質(zhì)量濃度為0.292 mg/mL)貯備液0.5、1、2、4、8、10、12 mL，置25 mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容，分別精密吸取上述對(duì)照品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算回歸方程為:齊墩果酸Y=13 064 278.2X，R=1;熊果酸Y=9 532 773.4X，r=0.999 9。齊墩果酸、熊果酸分別在0.029 4～0.705 6 μg、0.029 2～0.700 8 μg的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)精密吸取上述已配制好的齊墩果酸、熊果酸對(duì)照品溶液(每1 mL含齊墩果酸58.8 μg、熊果酸58.4 μg)，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣量為10 μL，結(jié)果齊墩果酸、熊果酸RSD分別為2.1%、0.60%。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)大蜜丸樣品(河北某藥業(yè)有限公司，批號(hào):090204)的樣品5份，水丸樣品(河北某制藥有限公司，批號(hào):090702)按供試品溶液的制備項(xiàng)下的方法制成供試品溶液，每份樣品進(jìn)2針，在上述色譜條件下，測(cè)定樣品齊墩果酸、熊果酸的峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果大蜜丸齊墩果酸、熊果酸RSD分別為2.0%、1.8%;水丸齊墩果酸、熊果酸RSD分別為1.6%、1.2%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一份大蜜丸供試品溶液，水丸供試品溶液按上述色譜條件分別于0、1、2、4、6、8 h測(cè)定，結(jié)果大蜜丸齊墩果酸、熊果酸RSD分別為2.2%、1.7%;水丸齊墩果酸、熊果酸RSD分別為2.0%、1.3%，說明樣品溶液在配制后8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)取已測(cè)定的大蜜丸(齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.13 mg/g、熊果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.46mg/g)9份，每份稱取約2.5g，精密稱定，分別精密加入齊墩果酸貯備液(0.294 mg/mL)1.30、1.10、0.90 mL各3份、熊果酸貯備液(0.292 mg/mL)5.00、4.00、3.00 mL各3份。取已知測(cè)定的水丸樣品(齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.22 mg/g、熊果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.52 mg/g)9份，每份稱取約1.25g，精密稱定，分別精密加入齊墩果酸貯備液(0.294 mg/mL)1.10、0.90、0.70 mL各3份、熊果酸貯備液(0.292 mg/mL)2.60、2.20、1.80 mL各3份。按供試品溶液制備項(xiàng)下的方法制成供試品溶液，并按上述色譜條件測(cè)定并計(jì)算回收率，結(jié)果大蜜丸齊墩果酸、熊果酸平均回收率分別為97.80%、97.60%，RSD分別為1.20%、0.98%;水丸齊墩果酸、熊果酸平均回收率分別為98.85%、99.27%，RSD分別為1.06%、1.10%。保和丸2種劑型加樣回收結(jié)果見表1。

3 樣品測(cè)定

3.1 齊墩果酸、熊果酸的測(cè)定按照上述樣品測(cè)定方法對(duì)收集到的來自6家生產(chǎn)企業(yè)的35批大蜜丸樣品、4家16批水丸樣品中齊墩果酸和熊果酸進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表2，并根據(jù)大蜜丸、水丸的服用量對(duì)齊墩果酸和熊果酸的攝入量進(jìn)行了比較，結(jié)果見表3。

3.2 橙皮苷的測(cè)定按照《中國(guó)藥典》2010年版一部方法對(duì)收集到的來自6家生產(chǎn)企業(yè)的35批大蜜丸樣品、4家16批水丸樣品中橙皮苷進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表2，并根據(jù)大蜜丸、水丸的服用量對(duì)橙皮苷的攝入量進(jìn)行了比較，結(jié)果見表4。

4 討論

4.1 取已配制好的齊墩果酸、熊果酸對(duì)照品溶液，進(jìn)行紫外掃描(200～400 nm)，二者均在206 nm附近有最大吸收，所以定210 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

4.2 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，分別采用甲醇-水-醋酸［2］、甲醇-水-冰乙酸-三乙胺［3］，甲醇-0.5%磷酸溶液［4］，乙腈-水［5］，乙腈-水-磷酸［6-7］，乙腈-1%冰醋酸溶液［8］，甲醇-水-磷酸［9］，乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨溶液［10-11］，乙腈-甲醇-0.6%醋酸銨溶液［12］作為流動(dòng)相，結(jié)果表明，乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨分離效果較好。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，最終確定流動(dòng)相為乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨(66∶5∶29)。

4.3 根據(jù)齊墩果酸、熊果酸的化學(xué)性質(zhì)及文獻(xiàn)報(bào)道［2-7］，分別采用甲醇、無水乙醇、75%乙醇、乙醚作為提取溶媒，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用無水乙醇、75%乙醇、甲醇提取的供試品溶液顏色較深，色譜峰雜質(zhì)多，難達(dá)到基線分離，用乙醚提取的供試品溶液顏色較淺，雜質(zhì)少，分離效果較好。

4.4 提取方法，分別采用超聲、水浴回流、索式回流提取樣品各1 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明索式回流提取的提取率高。

4.5 大蜜丸、水丸中齊墩果酸和熊果酸測(cè)定結(jié)果表明，大蜜丸生產(chǎn)企業(yè)所用山楂原料較為穩(wěn)定、均一，按次服用齊墩果酸和熊果酸量計(jì)，6家生產(chǎn)企業(yè)之間及各生產(chǎn)企業(yè)不同批次間藥品質(zhì)量比較穩(wěn)定。4家水丸生產(chǎn)企業(yè)藥品所含齊墩果酸和熊果酸量普遍較大蜜丸高，且個(gè)別生產(chǎn)企業(yè)不同批次間齊墩果酸和熊果酸量波動(dòng)較大，每丸齊墩果酸和熊果酸量的最大值是最小值的6倍多，單次服用攝入量差異更大，因此增加并統(tǒng)一保和大蜜丸、水丸中齊墩果酸和熊果酸的定量控制，更能有效控制藥品質(zhì)量均一性，以保證用藥的有效性。

表2 大蜜丸、水丸中橙皮苷、齊墩果酸、熊果酸測(cè)定結(jié)果(n=4，RSD≤2%)Tab.2 Determ ination resultes of hesperidin，aleanolic acid and ursolic acid in sam p les(n=4，RSD≤2%)

表3 大蜜丸和水丸齊墩果酸、熊果酸測(cè)定結(jié)果分析及服用量比較Tab.3 Content analyses and oral dose comparison of aleanolic acid and ursolic acid

表4 大蜜丸和水丸橙皮苷測(cè)定結(jié)果分析及服用量比較Tab.4 Content analyses and oral dose com parison of hesperidin

4.6 大蜜丸、水丸中橙皮苷測(cè)定結(jié)果表明，同一生產(chǎn)企業(yè)樣品不同批次橙皮苷定量較穩(wěn)定，不同生產(chǎn)企業(yè)樣品之間樣品橙皮苷定量差異較大。各生產(chǎn)企業(yè)藥品在符合現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的最低要求前提下，質(zhì)量存在參差不齊的情況，使得患者在服用不同生產(chǎn)企業(yè)藥品后療效可能出現(xiàn)差異。中藥成方制劑的定量測(cè)定項(xiàng)僅有下限控制而無上限控制，是造成不同生產(chǎn)企業(yè)樣品之間質(zhì)量差異的原因之一。

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