張瑩，毛春芹，陸兔林，2*，黃瑋，蘇桃，2，蔡寶昌，2

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210046;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210046)

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實(shí)，按醋蒸五味子生產(chǎn)工藝制備而得醋五味子飲片。主產(chǎn)于黑龍江、遼寧、吉林、河北等地。具有收斂固澀，益氣生津，補(bǔ)腎寧心之功效，主要用于久嗽虛喘，夢(mèng)遺滑精，遺尿尿頻，久瀉不止，自汗盜汗，津傷口渴，內(nèi)熱消渴，心悸失眠等癥的治療［1］?，F(xiàn)代研究表明，五味子主要化學(xué)成分為木脂素、揮發(fā)油及有機(jī)酸等三類有效成分［2-3］。具有保護(hù)肝臟［4］、抗氧化［5-6］、抗腫瘤［7］、抗衰老［8-9］、增強(qiáng)免疫功能［10］等多方面活性。

《中國(guó)藥典》2005年版一部44頁五味子含量測(cè)定項(xiàng)下對(duì)五味子采用了五味子醇甲作為其質(zhì)量控制的指標(biāo)。根據(jù)文獻(xiàn)研究及遼寧省主產(chǎn)地反饋的信息［11-12］，未成熟五味子果實(shí)中五味子醇甲含有量高于成熟的果實(shí)，而臨床上使用的是五味子成熟的果實(shí)。為了更好地科學(xué)地控制五味子的質(zhì)量，故將五味子醇甲及五味子乙素共同作為指標(biāo)性成分，對(duì)醋五味子飲片進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)研究，為規(guī)范飲片質(zhì)量、保證臨床療效提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent1100 LC高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司);色譜柱為Hypersil ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(大連依利特科技公司);AL104型電子天平(瑞士Mettler公司);KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);TGL—16臺(tái)式高速離心機(jī)(金壇市醫(yī)療儀器廠)。

1.2 試藥五味子醇甲對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用，批號(hào):110857-200605);五味子乙素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用，批號(hào):110765-200508)。甲醇(色譜純，Tediacompany)，水(超純水)，其余試劑均為分析純。

1.3 飲片生五味子飲片，購自五味子主產(chǎn)地遼寧、黑龍江等地，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院巢建國(guó)教授鑒定為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實(shí)，按醋蒸五味子生產(chǎn)工藝制備而得的醋五味子飲片。見表1。

表1 樣品來源及批次Tab.1 Sam p le sources and batches

2 薄層色譜鑒別

取醋五味子粉末1 g，加二氯甲烷20 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)佣燃淄? mL使溶解，作為供試品溶液。另取醋五味子對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取五味子甲素對(duì)照品，加二氯甲烷制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以展開系統(tǒng)1［石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)］的上層溶液及展開系統(tǒng)2［正己烷-乙酸乙酯(8∶3)］為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。比較薄層色譜的分離情況，最終確定將石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)展開系統(tǒng)列入標(biāo)準(zhǔn)正文。見圖1。

圖1 醋五味子薄層色譜圖Fig.1 TLC identification of Schisandra chinensis processed w ith vinegar

3 雜質(zhì)、水分、灰分及浸出物檢查

照《中國(guó)藥典》2005年版一部雜質(zhì)檢查法(附錄IXA)、水分測(cè)定法(附錄ⅨH第二法)、灰分測(cè)定法(附錄ⅨK法)、醇溶性浸出物測(cè)定法項(xiàng)下的熱浸法(附錄ⅩA)對(duì)10批次的醋五味子樣品進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算結(jié)果見表2、表3。

表2 不同批次醋五味子中雜質(zhì)、水分、灰分、浸出物Tab.2 Im purities，moisture，ash and extract contents of Schisandra chinensis processed w ith vinegar in different batches

表3 生五味子中雜質(zhì)、水分、灰分、浸出物Tab.3 Im purities，moisture，ash and extract contents of Schisandra chinensis

4 樣品測(cè)定

4.1 色譜條件Hypersil ODS色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇(A)-水(B)梯度洗脫，0～10 min(A為68%)，10～13 min(A為68%～77%)，13～30 min，(A為77%);柱溫30℃;體積流量1.0 mL/min;測(cè)定波長(zhǎng)250 nm;進(jìn)樣量10 μL。理論板數(shù)按五味子醇甲峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

4.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取五味子醇甲及五味子乙素對(duì)照品適量置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成含0.78 mg/mL五味子醇甲及0.956 mg/mL五味子乙素的混合對(duì)照品溶液。

4.3 供試品溶液的制備取醋五味子粉末(過三號(hào)篩)約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲(500 W)提取30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。

4.4 專屬性試驗(yàn)分別取對(duì)照品、醋五味子樣品、空白溶劑注入液相色譜儀中，按照上述色譜條件，進(jìn)樣10 μL，測(cè)定，結(jié)果見圖2。

圖2 對(duì)照品(A)、供試品(B)與空白溶液(C)HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of reference substances(A)，sample(B)and blank solution(C)

4.5 線性關(guān)系考察精密吸取上述對(duì)照品貯備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，分別置于5mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，使五味子醇甲質(zhì)量濃度分別為0.015 6、0.031 2、0.046 8、0.062 4、0.078、0.093 6、0.109 2 mg/mL;五味子乙素的質(zhì)量濃度分別為0.007 648、0.015 296、0.022 944、0.030 592、0.038 24、0.045 888、0.053 536 mg/mL。各對(duì)照品液分別進(jìn)樣10 μL，重復(fù)2次，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積均值(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。五味子醇甲回歸方程、相關(guān)系數(shù)以及線性范圍分別為:Y=20 247X+3.836，r=1.000 0;0.156～1.092 μg線性關(guān)系良好。五味子乙素回歸方程、相關(guān)系數(shù)以及線性范圍分別為:Y=16 538X－0.814，r=0.999 9;0.076 48～0.535 36 μg線性關(guān)系良好。

4.6 精密度試驗(yàn)取供試品溶液，按照上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各自峰面積，RSD值分別為0.18%、0.36%。結(jié)果表明儀器精密性良好。

4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液，每隔2 h進(jìn)樣1次，記錄五味子醇甲、五味子乙素18 h內(nèi)的峰面積，RSD分別為0.20%，0.43%。結(jié)果表明樣品在18 h內(nèi)穩(wěn)定性符合要求。

4.8 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)樣品，平行稱取6份，按4.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件測(cè)定五味子醇甲、五味子乙素，RSD分別為0.46%、0.37%，結(jié)果表明該方法具有較好的重復(fù)性。

4.9 加樣回收率試驗(yàn)精密稱取五味子醇甲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.78%，五味子乙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.57%的五味子粉末0.1 g，平行9份，分別置于具塞錐形瓶中，分別加入0.8、1.0、1.2 mL五味子醇甲對(duì)照品液(0.780 mg/mL)，及0.5、0.6、0.7 mL五味子乙素對(duì)照品液(0.956 mg/mL)各3份。按4.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定五味子醇甲、五味子乙素，計(jì)算準(zhǔn)確度，見表4。結(jié)果表明，準(zhǔn)確度良好，符合定量測(cè)定的要求。

4.10 樣品測(cè)定取不同批次醋五味子粉末0.2 g，精密稱定，每批樣品平行稱取2份，按照供試品溶液制備的方法制備，每一份樣品進(jìn)樣2次進(jìn)行測(cè)定。對(duì)10個(gè)批次的醋五味子樣品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表5、表6。

5 討論

5.1 根據(jù)不同產(chǎn)地醋五味子飲片實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果，按平均值的±20%作為限度制定幅度。暫定醋五味子飲片雜質(zhì)不得過0.7%，水分不得過13.0%，灰分不得過6.0%，浸出物量不得低于28.0%，含五味子醇甲和五味子乙素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得少于0.80%。

表4 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of recovery tests

表5 醋五味子的測(cè)定結(jié)果Tab.5 Content determ ination results of Schisandra chinensis processed w ith vinegar

表6 五味子的測(cè)定結(jié)果Tab.6 Content determ ination results of Schisandra chinensis

5.2 分別采用不同體系、不同比例的流動(dòng)相及不同色譜柱進(jìn)行色譜分離，最終確定色譜條件為:Hypersil ODS柱色譜(250×4.6 mm，5μm);流動(dòng)相為0～10 min，甲醇-水(68∶32)，10～13 min，甲醇(68→77)，13～30 min，甲醇-水(77∶23)。分離效果最佳。

5.3 醋五味子主要含有脂溶性成分，極性較小，故對(duì)其醇溶性浸出物進(jìn)行研究，考慮到指標(biāo)性成分的極性，最終選用95%的乙醇作為提取溶劑。此外，考慮到醇冷浸法時(shí)溫度差異對(duì)結(jié)果影響較大，因此選用熱浸法。

5.4 根據(jù)文獻(xiàn)研究及遼寧省主產(chǎn)地反饋的信息，未成熟五味子果實(shí)中五味子醇甲含有量高于成熟的果實(shí)，而臨床上使用的是五味子成熟果實(shí)，故在2005年版《中國(guó)藥典》五味子含量測(cè)定項(xiàng)下對(duì)五味子醇甲作為其質(zhì)量控制指標(biāo)的基礎(chǔ)上增加了五味子乙素共同作為定量控制的指標(biāo)性成分，更好地科學(xué)地控制醋五味子的質(zhì)量。

5.5 采用HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地醋五味子飲片中五味子醇甲、五味子乙素，結(jié)果顯示，該法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠、重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)，可用于醋五味子中有效成分定量測(cè)定和質(zhì)量控制。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2005年版一部［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:44.

［2］葛會(huì)奇，賈天柱.HPLC測(cè)定五味子的最佳采收期及五味子醇甲在果實(shí)中的分布［J］.中成藥，2007，29(6):862-864.

［3］逄世峰，鄭培和，許世泉.炮制對(duì)北五味子木脂素類成分的影響［J］.中成藥，2011，33(2):284-286.

［4］張明華，陳虹，李靈芝.五味子甲素和五味子醇甲對(duì)四氯化碳所致肝臟損傷的保護(hù)作用［J］.武警醫(yī)學(xué)，2002，13(7):395-396.

［5］謝宇，陳建光，孫新.4種五味子木脂素抗氧化作用實(shí)驗(yàn)研究［C］//第十屆全國(guó)心血管藥理學(xué)術(shù)會(huì)議2010(重慶)國(guó)際心血管疾病與藥物高峰論壇，2010:151-153.

［6］商紅軍，孟憲軍，李斌，等.北五味子乙素體外抗氧化及抑菌作用的研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，2(33):170-172.

［7］任麗佳，李林，殷放宙，等.五味子抗腫瘤活性成分及作用機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012，28(1):140-142.

［8］趙永德，崔惠玲，李娟.五味子的藥理作用及臨床應(yīng)用［J］.中華臨床醫(yī)藥與護(hù)理，2005，3(6):41.

［9］孫文娟，呂文偉，于曉鳳，等.北五味子粗多糖抗衰老作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2001，21(11):54-455.

［10］苗明三，方曉艷.五味子多糖對(duì)正常小鼠免疫功能的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)藥科技，2003，10(2):100-108.

［11］李寶巖.五味子資源調(diào)查與品質(zhì)評(píng)價(jià)［D］.沈陽:遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，2008.

［12］孫慶龍.北五味子種質(zhì)資源及評(píng)價(jià)研究［D］.哈爾濱:黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，2006.