黃其春，林藝丹，林梅香，洪燕萍，楊小燕，3*

(1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖364000;2.預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建龍巖364000;3.福建省人畜寄生與病毒性疫病防控工程技術(shù)中心，福建龍巖364000)

銀杏Ginkgo BilobaL.是世界上最古老的植物，為我國(guó)特有樹(shù)種，擁有量占世界總量的70%以上［1］。銀杏的藥用價(jià)值主要在其葉和果實(shí)，銀杏葉被用作藥物已有500余年的歷史，早在宋朝我國(guó)民間就使用銀杏葉治療哮喘和支氣管炎。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，銀杏葉中主要有效成分為黃酮類化合物、萜類化合物和聚戊烯醇等［2-3］，其中銀杏黃酮具有擴(kuò)張血管、抑制血小板活化因子、抗氧化、降血脂等作用［4-5］，對(duì)治療冠心病、心絞痛、高血壓和支氣管哮喘等有顯著效果。鑒于銀杏黃酮具有獨(dú)特的藥理作用、臨床治療和保健價(jià)值，把銀杏葉黃酮類化合物開(kāi)發(fā)成藥品和保健食品的研究已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)，而且新的銀杏葉提取純化工藝及新的測(cè)定方法研究也越來(lái)越受人們關(guān)注。

目前，銀杏葉的提取方法主要有有機(jī)溶劑浸取法、水浸取法、超聲波提取法等［6］，其中有機(jī)溶劑浸取法應(yīng)用最為廣泛。劉榮改等［7］在銀杏葉的有機(jī)溶劑提取工藝基礎(chǔ)上引入超微粉碎技術(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超微粉碎技術(shù)能改善銀杏葉的提取工藝。黃其春等［8］以水為溶出介質(zhì)，研究超微粉碎對(duì)銀杏葉中總黃酮溶出量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超微粉碎能提高銀杏葉中總黃酮的溶出量。中藥經(jīng)超微粉碎后，細(xì)胞的破壁率≥90%，細(xì)胞內(nèi)的有效成分充分暴露出來(lái)，其釋放速度及釋放量大幅度提高，增加了中藥的體外浸出度，從而提高藥效、節(jié)約資源、降低成本，使超微粉碎技術(shù)在中藥領(lǐng)域顯現(xiàn)出特有的優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景［9-10］。但是，有關(guān)超微粉碎技術(shù)對(duì)銀杏葉中總黃酮在動(dòng)物胃腸道中浸出的影響，還未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。為此，本試驗(yàn)?zāi)M胃腸道的不同pH條件，對(duì)銀杏葉細(xì)粉與超微粉中總黃酮的體外浸出情況進(jìn)行比較研究，旨在為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用我國(guó)豐富的銀杏葉資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 銀杏葉細(xì)粉和超微粉銀杏葉購(gòu)自陜西中鑫生物技術(shù)有限公司，銀杏葉細(xì)粉和超微粉委托江西省千目高科有限公司制備。

1.1.2 試劑蘆丁購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，乙醇、氯化鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、鹽酸均為分析純。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器AL104—1C電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);pH s—25數(shù)顯酸度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);BSD—250恒溫振蕩培養(yǎng)器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)和UV—3200 PCS紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定取少量蘆丁，用乙醇溶解后，再用原液(pH=2.23的浸出介質(zhì)，見(jiàn)表1)定容，靜置15 min，以原液為空白，在UV-3200 PCS紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上從波長(zhǎng)200～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.2 線性關(guān)系考察銀杏葉中總黃酮量的測(cè)定采用分光光度法［11］。準(zhǔn)確稱取經(jīng)干燥至恒質(zhì)量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用10 mL乙醇溶解后，用原液定容至50 mL，配成0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別準(zhǔn)確吸取該蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.000、0.125、0.250、0.375、0.500、0.625、0.750 mL于量瓶中，用原液定容至5 mL，靜置15 min后，以蘆丁質(zhì)量濃度為0.000 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以蘆丁質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，吸光度Y為縱坐標(biāo)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。

1.2.3 精密度實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.5 mL于量瓶中，用原液定容至5 m L，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果RSD為0.16%，說(shuō)明精密度良好。

1.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)準(zhǔn)確吸取同一批次銀杏葉超微粉浸出濾液6份，每份0.5 mL，分別用原液定容至5 mL，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算總黃酮量，結(jié)果RSD為0.50%，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

1.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)準(zhǔn)確吸取銀杏葉超微粉浸出濾液1.0 mL于量瓶，用原液定容至10 mL，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，每隔2 h測(cè)定1次，共測(cè)定5次，根據(jù)所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算總黃酮量，結(jié)果RSD為0.42%，表明樣品溶液在8 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

1.2.6 加樣回收試驗(yàn)準(zhǔn)確吸取已知總黃酮量的銀杏葉超微粉浸出濾液9份，每份0.5 mL，分別加入高、中、低3個(gè)梯度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(蘆丁加入量分別是樣品總黃酮量的80%、100%、120%，每個(gè)梯度3份)［12］，用原液定容至5 mL，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算總黃酮量，并計(jì)算加樣回收率［13］，結(jié)果平均回收率為99.90%，RSD為0.67%，表明樣品回收率良好。

1.2.7 銀杏葉中總黃酮體外浸出量的測(cè)定按表1制備原液和Ⅰ～Ⅳ號(hào)浸出介質(zhì)，模擬胃腸道不同的pH條件［14］。取適量的原液于37℃恒溫振蕩器中預(yù)熱。分別稱取15 g銀杏葉細(xì)粉和超微粉于具塞三角錐形瓶中，加入30倍藥量已預(yù)熱的原液，在轉(zhuǎn)速為100 r/min、溫度為(37±0.5)℃的浸出條件下振蕩。當(dāng)銀杏葉細(xì)粉和超微粉完全浸入到原液中后開(kāi)始計(jì)時(shí)，按表2中的取樣時(shí)間用針頭過(guò)濾器吸取浸出液2.5 mL，隨即補(bǔ)充同溫度同體積的Ⅰ～Ⅳ浸出介質(zhì)。取適量的續(xù)濾液，按上述方法在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度后由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算得出其中的總黃酮量，然后按以下公式計(jì)算出各個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)總黃酮的累積浸出量［15］。各取樣時(shí)間點(diǎn)總黃酮的累積浸出量(mg/g)=［Cn×b×V2+(Cn－1+Cn－2+…+C2+C1)×b×V1］/m，其中Cn為所測(cè)樣品質(zhì)量濃度(mg/mL)、V2為浸出介質(zhì)總體積(mL)、V1為取樣體積(mL)、b為稀釋倍數(shù)、m為樣品加入量(g)。

表1 不同pH浸出介質(zhì)的組成

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS13.0軟件中ANOVA模塊進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定黃酮類化合物在190～400 nm的區(qū)域內(nèi)存在兩個(gè)主要的紫外吸收帶，即峰帶Ⅰ(300～400)nm和峰帶Ⅱ(220～280)nm。紫外掃描結(jié)果表明，蘆丁在波長(zhǎng)255 nm和350 nm處均有最大吸收峰，而且在波長(zhǎng)350 nm處吸收峰明顯?？紤]到許多物質(zhì)(溶劑等許多非黃酮類物質(zhì))在波長(zhǎng)258 nm左右均有吸收，雜質(zhì)干擾大，因此選擇350 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2 線性關(guān)系的考察求得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=24.971X+0.009 1，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，表明蘆丁溶液在0.000～0.030 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其質(zhì)量濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.3 銀杏葉中總黃酮的浸出量銀杏葉中總黃酮的浸出量見(jiàn)表2。由表2可知，在模擬胃腸道的浸出介質(zhì)中，銀杏葉細(xì)粉和超微粉中總黃酮的累積浸出量隨著浸出時(shí)間的增加而增加。在浸出的起始階段(15～180 min)，銀杏葉細(xì)粉和超微粉中總黃酮均有一個(gè)較快的浸出過(guò)程，隨后總黃酮的浸出速度逐漸減慢，銀杏葉細(xì)粉中總黃酮在4 h后基本不再浸出，銀杏葉超微粉中總黃酮仍有少量浸出。在各個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)，銀杏葉超微粉中總黃酮的累積浸出量均顯著高于銀杏葉細(xì)粉中總黃酮的累積浸出量(P＜0.01)，其增加幅度達(dá)7.4%～21.7%。

表2 銀杏葉細(xì)粉和超微粉在不同取樣時(shí)間點(diǎn)總黃酮的累積浸出量

3 討論

目前，超微粉碎技術(shù)在中藥領(lǐng)域已顯現(xiàn)出特有的優(yōu)勢(shì)，并廣泛應(yīng)用于中藥生產(chǎn)。劉榮改等［7］、黃其春等［7］分別報(bào)道超微粉碎技術(shù)能改善銀杏葉的提取工藝、提高銀杏葉中總黃酮的溶出量。但是，有關(guān)超微粉碎技術(shù)對(duì)銀杏葉中總黃酮在動(dòng)物胃腸道中浸出的影響還未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)?zāi)M胃腸道的不同pH條件，對(duì)銀杏葉細(xì)粉與超微粉中總黃酮的體外浸出情況進(jìn)行了比較研究。為更好地模擬藥物在胃腸道中的轉(zhuǎn)運(yùn)情況，除配制不同pH值的緩沖液作為浸出介質(zhì)外［14］，取樣時(shí)間的設(shè)定主要是參考藥物在胃中(pH 2.23～4)停留約2 h，小腸中(pH 7.4左右)停留約4 h，大腸中(pH 7.8以上)停留約2 h而確定的。前4 h pH變化大，取樣間隔為15 min;后4 h pH變化小，取樣間隔為30 min［16］。試驗(yàn)結(jié)果表明，在模擬胃腸道的浸出介質(zhì)中，銀杏葉細(xì)粉和超微粉中總黃酮在起始的15～180 min浸出較快，前4 h(pH 2.23～6.96)的浸出量較多。而在后4 h(pH 7.06～8.5)，銀杏葉細(xì)粉中總黃酮基本不再浸出，銀杏葉超微粉中總黃酮仍有少量浸出。在各個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)，銀杏葉超微粉中總黃酮的累積浸出量均顯著高于銀杏葉細(xì)粉中總黃酮的累積浸出量(P＜0.01)。究其原因，可能與銀杏葉細(xì)粉和超微粉細(xì)胞壁完整性、粒徑以及比表面積大小有關(guān)。銀杏黃酮等有效成分主要存在于銀杏葉的細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞壁完好的情況下，黃酮等有效成分需經(jīng)過(guò)浸潤(rùn)、溶脹、滲透和擴(kuò)散等過(guò)程，方能從細(xì)胞質(zhì)中穿過(guò)細(xì)胞膜和細(xì)胞壁擴(kuò)散到浸出介質(zhì)中，這一過(guò)程進(jìn)行的比較緩慢，而且不能進(jìn)行完全。銀杏葉經(jīng)過(guò)超微粉碎后，難以看到完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞破壁率很高，粒徑變小，比表面積增大［8，17］，這不僅使黃酮等有效成分充分暴露出來(lái)，其浸出不受細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的阻礙，直接溶解到浸出介質(zhì)中，而且還使黃酮等有效成分與浸出介質(zhì)間的有效接觸面積增大，浸出介質(zhì)進(jìn)入顆粒中心的距離縮短，進(jìn)而導(dǎo)致黃酮等有效成分浸出速度加快，浸出量增加，該過(guò)程進(jìn)行很快，而且比較徹底。

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