植物細胞制藥的研究進展

趙玉平 楊夏 高峰麗

（內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院藥劑科，包頭014010）

植物細胞制藥的研究進展

趙玉平 楊夏 高峰麗

（內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院藥劑科，包頭014010）

植物細胞工程制藥是植物細胞技術(shù)在生物制藥工業(yè)方面的應(yīng)用。本文介紹了植物細胞工程制藥所涉及的主要技術(shù)及其進展，包括大規(guī)模植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥用成分，植物生物反應(yīng)器，生物酶解技術(shù)，轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)藥物等，在此基礎(chǔ)上探討了植物細胞工程制藥的發(fā)展趨勢。

植物細胞；制藥；細胞培養(yǎng)；酶解技術(shù)

植物細胞技術(shù)在當(dāng)今的醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣泛，植物細胞的大量培養(yǎng)是利用植物細胞體系通過現(xiàn)代生物工程手段進行工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)上人類從植物中得到藥物已有很長的歷史。隨著植物細胞培養(yǎng)、植物基因工程等生物技術(shù)的發(fā)展，它被賦予了新的內(nèi)容和廣闊的發(fā)展前景。直接提取有用化合物或者以植物提取物為底物合成其結(jié)構(gòu)類似物成為人們治療疾病重要方法。研究植物次級代謝，進一步提高細胞培養(yǎng)過程中細胞生長的速率及選育出穩(wěn)定高產(chǎn)的優(yōu)良細胞系，是提高植物細胞生產(chǎn)目標化合物的效率的重要途徑。植物細胞培養(yǎng)技術(shù)現(xiàn)已發(fā)展成為一門精細的實驗科學(xué)，在材料消毒、接種培養(yǎng)、繼代保存、分離鑒定等方面建立了一套系統(tǒng)的操作程序[1]，在今后的醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)⒂懈鼜V闊的天地。

1 大規(guī)模植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥用成分

植物細胞的大量培養(yǎng)是利用植物細胞體系通過現(xiàn)代生物工程手段進行工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，以獲得各種產(chǎn)品的一門新興的跨學(xué)科技術(shù)。首次提出從植物細胞培養(yǎng)物中合成天然藥物的是1956年美國的Routier和Nickell，1967年KauI和Staba采用多升發(fā)酵罐對小阿米（Ammi Visnaga）進行了細胞大量培養(yǎng)的研究，并首次用此方法得到了藥用成分呋喃色酮[2]。

細胞工程制藥是利用動植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)人類生理活性因子、單克隆抗體、動物疫苗和植物藥物等產(chǎn)品[3]。植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)抗癌藥物紫杉醇，紫杉醇（taxel）是種用于卵巢癌、乳腺癌、肺癌的高效、低毒、廣譜并且作用機制獨特的抗癌藥物，被譽為20世紀90年代國際上抗腫瘤藥三大成就之一。但自1993年紫杉醇上市以來，紫杉醇的來源問題成為世界性的研究熱點。植物細胞培養(yǎng)被公認為是生產(chǎn)紫杉醇一種長期有希望的方法。日本曾從短葉紅豆杉7川jbrevlfolia Nutt和東北紅豆杉T．cuspidatu Sieb．et Zucc．中進行愈傷組織的誘導(dǎo)、篩選得到的細胞株，可在4周培養(yǎng)時間內(nèi)細胞增殖5倍。同時紫杉醇含量達到0.05%，比原來的紅豆杉樹皮紫杉醇含量增加了l0倍[4]。

2 植物生物反應(yīng)器

廣義上講，植物生物反應(yīng)器是指以植物懸浮細胞培養(yǎng)、天然的或經(jīng)基因工程改良的植物細胞和組織，或整株植物為“工廠”大量生產(chǎn)具有藥用價值（如人類或動物的疫苗、抗體），或可作為工業(yè)原料的植物次生代謝產(chǎn)物、食品添加劑等重要應(yīng)用價值的蛋白或氨基酸[5]。從狹義上講，植物生物反應(yīng)器是指以轉(zhuǎn)基因的整株植物為“工廠”來大量生產(chǎn)各種價值及附加值高的生物制品[6]。利用植物生物反應(yīng)器表達外源藥用蛋白和疫苗，可解決許多藥用蛋白和疫苗的來源問題，并降低生產(chǎn)成本，從而形成生物制藥企業(yè)的核心競爭力，產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟效益。

1992年，梅森、劉玉樂等將乙型肝炎表面抗原基因轉(zhuǎn)入煙草，獲得的轉(zhuǎn)基因植株所表達的抗原蛋白。其免疫原性與從人和酵母來源的相似，保留了B細胞和T細胞的抗原決定簇。1999年麥考密克等通過煙草花葉病毒(TMV)載體在煙草中表達了小鼠B細胞淋巴瘤中一段特異編碼區(qū)，用該編碼區(qū)產(chǎn)生的蛋白來免疫小鼠。后者產(chǎn)生相應(yīng)的特異抗體，這種抗體可保護小鼠不受該腫瘤致死劑量的攻擊。這種腫瘤特異蛋白疫苗的快速生產(chǎn)系統(tǒng)可能為治療非霍奇金淋巴瘤提供一種實用的策略[7]。

3 細胞級微粉碎加工技術(shù)

中藥超微粉碎（又稱中藥微粉化）是隨著現(xiàn)代粉體工程微粉化技術(shù)——超微粉體技術(shù)的發(fā)展在20世紀90年代中后期而新興的一門中藥加工技術(shù)?！俺⒅兴帯笔侵高\用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)（現(xiàn)代細胞破壁技術(shù)）與傳統(tǒng)中藥炮制技術(shù)相結(jié)合的先進工藝，將傳統(tǒng)中藥飲片加工成一種粒徑為微米級的新型中藥，也可叫做“微粉中藥”、“中藥超微飲片”、“中藥超細粉體”。超微粉體技術(shù)作為一門跨學(xué)科、跨行業(yè)的高新技術(shù)，已引起科技界和中醫(yī)藥界的廣泛關(guān)注，并已成為近幾年來中藥界的研究熱點[8]。

陳宇紅[9]用高頻振動磨對根系植物中藥黃芪進行了超細粉碎，結(jié)果黃芪經(jīng)超細粉碎至細胞破壁后，可顯著提高其有效成分的溶出量和溶出速率，從而增加藥效，顯示了超細粉碎技術(shù)作為一種高新技術(shù)在中藥加工中有特有的優(yōu)勢。

4 生物酶解技術(shù)

中藥制劑的雜質(zhì)大多為淀粉、果膠、蛋白質(zhì)等，針對雜質(zhì)可選用合適的酶法予以分解除去。酶反應(yīng)較溫和地將植物組織分解，可以較大幅度提高收率。目前，用于中藥提取方面研究較多的是纖維素酶，大部分的中藥材的細胞壁是由纖維素構(gòu)成，植物的有效成分往往包裹在細胞壁內(nèi)，纖維素則是由β-D-葡萄糖以1，4-β葡萄糖苷鍵連接，用纖維素酶酶解可以破壞β-D-葡萄糖鍵，使植物細胞壁破壞，有利于對有效成分的提取[10]。在國內(nèi)，上海中藥一廠首先應(yīng)用酶法成功地制備了生脈飲口服液[11]。

呂衛(wèi)明等[12]介紹了一種從黃芩中提取分離黃芩素的新方法—酶水解法，并且和直接提取法相比較，結(jié)果新方法所得粗品中黃芩素達75.67%，收率為2.46%。李元波等[13]利用纖維素酶預(yù)處理提取郁金中姜黃素，與乙醇回流法作對照，工藝流程中除去酶預(yù)處理步驟，其余工藝條件完全相同，經(jīng)酶預(yù)處理法的姜黃素的提取率達到0.0773%，比乙醇回流法的提取率提高了15%，干膏率提高了7.0%，且薄層色譜圖表明酶預(yù)處理提取法提取姜黃素穩(wěn)定，纖維素的酶解作用對提取成分無影響。顯示將纖維素酶用于某些單一中藥的預(yù)處理有良好的應(yīng)用前景。

有文獻報道日本的高根芳春[14]提出了用酶法提取銀杏葉有效成分的方法。通過加入糊精以及對葡萄糖殘基有轉(zhuǎn)移作用的葡萄糖苷酶或轉(zhuǎn)糖苷酶，使油溶性或難溶于水或不溶于水的有效成分轉(zhuǎn)變成易溶于水的成分而提取出來。

5 轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)藥物

植物醫(yī)藥基因工程是指把重組的編碼的活性多膚和疫苗基因?qū)酥参?，使植物能夠大量生產(chǎn)這些活性膚和疫苗，它是土廠化農(nóng)業(yè)（factoryfoming）或分子農(nóng)業(yè)最具誘惑力的部分。這種策略，不僅可以大大降低昂貴藥命的生產(chǎn)成本，而且簡化了貯藏方式。因此，國際上植物基因工程研究的一個新趨勢就是利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)藥物[15]。

植物抗體是將動物和人抗體基因轉(zhuǎn)入植物中使其表達產(chǎn)生免疫性產(chǎn)物。利用禾谷類作物能生產(chǎn)ScFVT84.66抗癌胚抗原；利用大豆能生產(chǎn)HSV的糖蛋白；利用煙草能生產(chǎn)線蟲抗原、外傷素、Streptococcus.mutans抗原、結(jié)腸癌抗原、IgGtScFv、人肌酸激酶特異的IgG[16]。

現(xiàn)還有一種新思路，以病毒為載體在植物中生產(chǎn)藥用蛋白，這種方法是先將目的基因插入病毒基因組中，然后把重組病毒接種到植物葉片上任其蔓延至所有葉片，外源基因則隨病毒的復(fù)制而得到高水平的表達，這樣的植物就成了生產(chǎn)蛋白質(zhì)的“綠色工廠”[17]。

6 植物細胞生產(chǎn)有用次生代謝產(chǎn)物

次生代謝產(chǎn)物的低產(chǎn)現(xiàn)象是制約細胞培養(yǎng)法生產(chǎn)植物天然產(chǎn)物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的核心問題之一，理解和掌握植物細胞次生代謝調(diào)控規(guī)律是解決這一問題的基礎(chǔ)。與初生代謝相比，植物次生代謝產(chǎn)物的合成具有更加復(fù)雜的調(diào)控機制，并且更易受外界因素的影響[18]。

我們最近的研究結(jié)果表明，在桔青霉細胞壁誘導(dǎo)子處理約2h后，紅豆杉懸浮細胞中NO開始增加并在6h左右時達到最高，隨后出現(xiàn)下降，表明真菌誘導(dǎo)可以誘發(fā)紅豆杉細胞中NO的生物合成[19]。

7 展望

植物細胞是一個復(fù)雜的體系，其內(nèi)部存在多種反饋調(diào)控機制，各種亞體系之間也存在著復(fù)雜的相互影響，在培養(yǎng)過程中植物細胞具有相當(dāng)?shù)倪z傳和生理的不穩(wěn)定性，加強對培養(yǎng)過程中植物細胞特性的研究，努力從生命和細胞的總體的和本質(zhì)的角度去思考，進行反應(yīng)器的研制，將有可能在植物細胞培養(yǎng)工作中取得根本上的突破。

植物細胞培養(yǎng)是近代實驗植物學(xué)的主要工具之一，高等植物的遺傳工程也需要細胞培養(yǎng)技術(shù)，使經(jīng)由遺傳因子轉(zhuǎn)移的細胞，再分化成有利用價值的植株。提取高價值的化合物或?qū)崿F(xiàn)種苗的工廠化生產(chǎn)，對于保護珍稀的野生植物資源，突破時間和地域的限制進行農(nóng)業(yè)生產(chǎn)都是有所裨益的。同時，植物細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器的研制必須從實用出發(fā)，考慮到工業(yè)放大的可行性，過去的研究大多僅僅是實驗室的成果，植物細胞培養(yǎng)的工業(yè)化技術(shù)仍不過關(guān)，生產(chǎn)過程還不能長期穩(wěn)定地進行，限制了植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的應(yīng)用[20]。

探索天然藥物的生產(chǎn)工業(yè)化是當(dāng)前藥物研究的一個新方向，應(yīng)用發(fā)展的眼光看待植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物應(yīng)用前景，控制植物細胞培養(yǎng)過程，提高目標化合物的含量。利用植物基因工程方法生產(chǎn)藥物還剛剛開始，有很大的發(fā)展空間。有科學(xué)家估計，植物生物技術(shù)的發(fā)展將改變半個多世紀以來許多新藥單純依賴化學(xué)合成的狀況，把人類的醫(yī)藥行業(yè)帶向一個新的里程碑。

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10.3969/j.issn.1672-2779.2012.12.116

：1672-2779（2012）-12-0163-02

：韓世輝

2012-04-10）