慢性間斷性缺氧伴二氧化碳潴留小鼠模型的建立

劉海林，張子彥，郭云云，李景春，宋永斌，徐江濤

（蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，烏魯木齊 830000）

睡眠呼吸暫停綜合征（sleep apnea syndrome，SAS）的病理生理機(jī)制本質(zhì)上是一個(gè)慢性間斷性缺氧伴二氧化碳潴留（chronic intermittent hypoxia with carbon dioxide retention，CIH-CR）的過程。大量的研究表明，SAS是多種疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可導(dǎo)致心、肺、腎、腦及血液等器官或系統(tǒng)損害［2］。建立理想的SAS動(dòng)物模型對(duì)研究其發(fā)病機(jī)制及治療有重要意義。本研究旨在建立一種成本低廉、操作簡(jiǎn)便、易于推廣、符合SAS病理生理學(xué)特征CIH-CR的動(dòng)物模型。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級(jí)健康雄性昆明種小白鼠，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證［SCXK（新）2003-0001］，體重18～22g，共22只。分為常氧（normal control，NC）及CIH-CR組，每組11只。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

自制實(shí)驗(yàn)倉(cāng)（包括：有機(jī)玻璃、繼電器、微動(dòng)電極、牽引器、不銹鋼套管）；CY212C型測(cè)氧儀（浙江電化分析儀器廠），EM-21型便攜式二氧化碳檢測(cè)儀（連云港金升科技有限公司），PC-68B血氧飽和度儀（深圳市科瑞康實(shí)業(yè)有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CIH-CR實(shí)驗(yàn)倉(cāng)及其工作原理：本實(shí)驗(yàn)倉(cāng)規(guī)格為45.3×22.0×4.9 cm。倉(cāng)底部有通氣孔并與打好孔的不銹鋼套管相連，通過兩個(gè)牽引器控制通氣孔的開啟與關(guān)閉，關(guān)閉（缺氧處理）與開啟（復(fù)氧處理）時(shí)間由兩個(gè)繼電器控制，開啟與關(guān)閉時(shí)間可依實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整，達(dá)到給予小鼠反復(fù)缺氧/復(fù)氧自動(dòng)循環(huán)的目的。二氧化碳檢測(cè)儀固定于倉(cāng)內(nèi)，實(shí)驗(yàn)倉(cāng)頂端預(yù)留測(cè)氧孔。實(shí)驗(yàn)期間小鼠活動(dòng)自如，自由飲食。

實(shí)驗(yàn)倉(cāng)工作原理：關(guān)閉實(shí)驗(yàn)倉(cāng)時(shí)，小鼠呼吸倉(cāng)內(nèi)有限的O2排出CO2造成低O2和CO2潴留，然后使實(shí)驗(yàn)倉(cāng)與外界相通形成復(fù)氧，O2和CO2濃度迅速恢復(fù)正常水平。循環(huán)時(shí)間由繼電器自動(dòng)控制，每次循環(huán)150s，其中關(guān)閉時(shí)間為120s，開啟時(shí)間為30 s，每天8 h（10∶00～18∶00），其余時(shí)間置小鼠飼養(yǎng)籠，室溫、空氣、正常飲食。NC組每日同時(shí)置相同規(guī)格有機(jī)玻璃箱內(nèi)，箱內(nèi)開放，不形成缺O(jiān)2和CO2潴留。間斷性缺氧實(shí)驗(yàn)過程中箱內(nèi)氣體濃度由二氧化碳檢測(cè)儀和測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)。

為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)倉(cāng)的效果，測(cè)定10只小鼠在此間斷缺氧條件下尾部末端SO2變化情況，方法為：先將小鼠用苯巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，放入實(shí)驗(yàn)倉(cāng)中，尾部通過預(yù)留孔伸出倉(cāng)外，使用血氧飽和度儀測(cè)尾部末梢SO2。

1.3.2 右室肥厚指數(shù)計(jì)算：實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉30 mg/kg體重，直接開胸切取心臟，在房室瓣水平去除心房、大血管和心包組織，沿室間隔分離左心室（包括室間隔）和右心室，冰鹽水沖洗干凈，清潔濾紙吸干水份后稱左心室（含室間隔）濕重和右心室濕重，計(jì)算右心室濕重/左心室（含室間隔）濕重（RV/LV+S），即為右心室心肌肥厚指數(shù)［3］。

1.3.3 病理觀察：實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)取小鼠心、肺、腎、腦組織以10％的甲醛固定、石蠟切片、常規(guī)HE染色，光鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 CIH-CR實(shí)驗(yàn)倉(cāng)內(nèi)O2濃度、CO2濃度和小鼠尾部末端SO2周期性變化動(dòng)態(tài)測(cè)定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)倉(cāng)內(nèi) O2濃度、CO2濃度和小鼠尾部末端SO2見表1及圖1，圖2，圖3。

表1 10個(gè)循環(huán)周期中缺氧箱內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)O2濃度（％）、CO2濃度（‰）及小鼠尾部末端SO2（％）Tab.1 The concentration of O2，CO2 and the SO2 in the empennage ofmouse in the cabin in 10 cycle

圖1 箱內(nèi)O2濃度變化趨勢(shì)Fig.1 The change trend of O2 concentration in the cabin

圖2 箱內(nèi)CO2濃度變化趨勢(shì)Fig.2 The change trend of CO2 concentration in the cabin

圖3 小鼠尾部末端血SO2變化趨勢(shì)Fig.3 The change trend of the SO2 in the empennage ofmouse in the cabin

2.2 CIH-CR組小鼠右室肥厚指數(shù)的影響

NC組和CIH-CR組小鼠右室肥厚指數(shù)分別為0.21±0.03和0.30±0.02，與NC組相比，CIH-CR組小鼠右心肥厚指數(shù)明顯升高（P＜0.01）。

2.3 心、肺、腎和腦組織HE染色結(jié)果

2.3.1 小鼠心肌組織病理學(xué)改變：NC組小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)正常，肌纖維排列規(guī)則，間質(zhì)無明顯水腫。CIH-CR組小鼠心肌細(xì)胞可見核腫脹，間質(zhì)水腫，偶見輕度嗜酸性變，見封3圖4～5。

2.3.2 小鼠心組織病理學(xué)改變：NC組組胞壁薄，血管壁較光滑，與對(duì)照組比較，CIH-CR組小鼠肺泡腔體積變小，血管擴(kuò)張充血，肺間質(zhì)增多，肺泡間質(zhì)毛細(xì)血管增多，見封3圖6～7。

2.3.3 小鼠腎臟組織病理學(xué)改變：NC組腎小球、腎小管細(xì)胞及上皮細(xì)胞排列整齊，胞漿均勻；CIH-CR組腎小球腎小管上皮腫脹，管腔消失，部分腎小管內(nèi)有蛋白管型，見封3圖8～9。

2.3.4 小鼠腦組織病理學(xué)改變：NC組神經(jīng)元 大小、形態(tài)正常；CIH-CR組性神經(jīng)元明顯增加，細(xì)胞腫脹突出，胞漿空泡增大，細(xì)胞皺縮，胞體深染，見封3圖10～11。

3 討論

目前，在已發(fā)表的SAS動(dòng)物模型中，不同的實(shí)驗(yàn)缺氧-復(fù)氧循環(huán)時(shí)間30～300 s不等，每天總?cè)毖鯐r(shí)間5～8 h不等，缺氧累計(jì)天數(shù)14～70 d不等，最低O2濃度3％ ～10％不等。對(duì)二氧化碳是否潴留觀點(diǎn)不一［4-8］，不同研究者的實(shí)驗(yàn)方案重復(fù)性和可比性較差。造成低氧的方式主要是向缺氧裝置中沖入氮?dú)饣驂嚎s空氣與混合氣體［7，9］，可以對(duì)缺氧時(shí)間及程度精確控制，但儀器成本較高，不利于推廣。

本實(shí)驗(yàn)采用小鼠作為 CIH-CR模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，根據(jù)小鼠晝伏夜出的習(xí)性，每天間斷缺氧在日間進(jìn)行（10∶00～18∶00）。在間斷缺氧箱密閉后，由于小鼠呼吸箱內(nèi)有限O2，排出CO2，箱內(nèi)O2濃度逐漸降至 10％ ±1.3％，CO2濃度逐漸升至979.7±39.8％。給予通氣后箱內(nèi) O2濃度在120 s左右迅速升高至 20％ ±0.9％，CO2濃度降至343.6±12.8％。同時(shí)檢測(cè)血氧飽和度發(fā)現(xiàn)，缺氧最低點(diǎn)時(shí) SO2為71.2±2.1％，當(dāng)恢復(fù)至正常氧濃度時(shí)SO2為93.5±2.2％，類似于SAS患者血氧濃度變化曲線，說明該模型能模擬SAS的血氧特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4周后模型組小鼠右心室明顯肥大（P＜0.01），提示4周的 CIH-CR循環(huán)可模擬 SAS。并且組織病理學(xué)表現(xiàn)符合低氧后改變，進(jìn)一步從形態(tài)學(xué)角度說明本研究制備了可靠的SAS小鼠模型。

我們的實(shí)驗(yàn)是通過小鼠的自主呼吸耗竭O2，產(chǎn)生CO2，符合SAS逐漸缺氧和高CO2的生理過程。本實(shí)驗(yàn)箱通過電控閥控制箱的開啟和閉合，可調(diào)節(jié)缺氧時(shí)間，從而可根據(jù)需要制作不同程度的SAS模型。實(shí)驗(yàn)箱在電極轉(zhuǎn)換調(diào)控閥門時(shí)產(chǎn)生一定的聲音，不斷干擾小鼠的睡眠，符合SAS對(duì)睡眠結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響的過程。箱內(nèi)剛好容納22只小鼠，此空間小鼠耐受良好，便于觀察小鼠呼吸及自主運(yùn)動(dòng)情況，且可以成批復(fù)制小動(dòng)物模型。本模型設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，成本低廉，易于推廣。

總之，雖該實(shí)驗(yàn)箱存在一些缺點(diǎn)，但因其符合SAS病理過程，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，成本低廉，不失為一種理想的SAS模型實(shí)驗(yàn)箱。

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