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      吡格列酮對db/db小鼠骨骼肌蛋白酪氨酸磷酸酶1B表達的影響

      2012-02-01 09:28:04邵加慶
      中國比較醫(yī)學(xué)雜志 2012年1期
      關(guān)鍵詞:列酮吡格骨骼肌

      盧 斌,顧 萍,邵加慶,杜 宏,王 堅

      (南京軍區(qū)南京總醫(yī)院內(nèi)分泌科,南京 210002)

      骨骼肌胰島素抵抗是肥胖和2型糖尿病發(fā)生的 重要機制。研究發(fā)現(xiàn)蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B,PTP1B)負性調(diào)節(jié)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo),其表達增加及活性增強可以導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生。吡格列酮作為胰島素增敏劑改善胰島素抵抗,但其作用機制尚未明確。本研究通過吡格列酮干預(yù)來觀察其對db/db小鼠骨骼肌PTP1B表達的影響,探討吡格列酮改善胰島素敏感性的可能作用機制。

      1 材料和方法

      1.1 實驗動物與分組:

      C57BL/KsJ db/db小鼠購自美國 Jackson實驗動物中心,并在本院實驗動物中心繁育成功(SCXK[軍]20072012)。實驗期間小鼠在層流柜中飼養(yǎng),所有器具及食物均消毒,無菌操作。小鼠自由進食、進水,保持墊料干燥,溫度保持在23℃,12 h/12 h亮暗周期。按隨機數(shù)字表將小鼠分為吡格列酮組10只和db/db對照組10只,每日固定時間分別給予吡格列酮(艾汀,北京太洋藥業(yè)有限公司生產(chǎn))10 mg/kg體重和相同體積的安慰劑(5%阿拉伯膠)灌胃,連續(xù)給藥4周,另選取10只同周齡同窩出生的C57BL/KsJ db/m小鼠給予安慰劑灌胃作為非糖尿病對照組(db/m組)。實驗結(jié)束,所有動物麻醉處死取骨骼肌,凍存于-70℃。

      1.2 觀察指標

      1.2.1 生理生化指標 每周監(jiān)測小鼠體重和空腹血糖,投藥前和投藥4周后測定空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)。血糖測定使用強生公司生產(chǎn)的One-Touch血糖儀。血清胰島素水平的測定采用小鼠胰島素 ELISA試劑盒(Morinaga,Yokohama, Japan)。胰島素敏感性用 HOMA胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR,HOMA-IR=FPG×FINS/22.5)來評價。1.2.2 PTP1B蛋白表達的測定 提取骨骼肌蛋白,采用BCA蛋白定量試劑盒檢測總蛋白濃度,取50 ug蛋白經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,封閉后加入羊抗鼠PTP1B多克隆抗體(Santa Cruz公司)過夜孵育,洗膜后加入生物素標記的兔抗羊 IgG抗體(Santa Cruz公司)孵育2 h,洗膜后用 ECL增強顯色。同時用同樣方法對上述樣品用抗鼠的β-actin單克隆抗體免疫雜交與顯色作為內(nèi)參對照。用BioRad Flour-S成像儀將膠片進行掃描,用凝膠圖象處理系統(tǒng)進行半定量分析。

      1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

      2 結(jié)果

      2.1 生理生化指標

      4周齡db/db小鼠進入試驗時已表現(xiàn)為肥胖,血糖升高,高胰島素水平,與 db/m組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而吡格列酮組與db/db對照組小鼠上述指標間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。吡格列酮組小鼠在給予藥物干預(yù) 4周后FBG、FINS水平及 HOMA-IR均顯著低于 db/db對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

      表1 3組小鼠的體重及生理、代謝指標比較Tab.1 The comparison of weight,physiological and metabolic parameters

      2.2 Westernblot檢測PTP1B蛋白表達

      應(yīng)用WB檢測各組小鼠骨骼肌PTP1B蛋白的表達,結(jié)果顯示,db/db組小鼠骨骼肌 PTP1B表達顯著高于db/m組(P<0.05),給予吡格列酮干預(yù)4周后,吡格列酮組db/db小鼠骨骼肌PTP1B表達水平較 db/db對照組顯著降低(P <0.05)(圖1)。

      3 討論

      db/db小鼠是一種先天肥胖性2型糖尿病小鼠模型,由于瘦素受體基因發(fā)生突變所致。一般于出生后3~4周即可表現(xiàn)為肥胖,血糖升高,胰島素抵抗等特性,是研究2型糖尿病的理想模型。本研究中4周齡db/db小鼠表現(xiàn)為高血糖、體重增加,胰島素抵抗指數(shù)增加,與對照組相比有顯著性差異。

      圖1 圖1 各組小鼠骨骼肌PTP1B蛋白表達量Fig.1 PTP1B protein expression in muscle of each group

      肥胖、胰島素抵抗的機制目前尚未完全闡明。研究發(fā)現(xiàn)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受到正負調(diào)節(jié)蛋白的協(xié)同作用,而在眾多負調(diào)節(jié)因子中PTP1B作用突出。PTP1B是蛋白酪氨酸磷酸酶家族中的一員,在人體多種組織細胞中普遍存在,主要位于胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面,它通過使激活的胰島素受體及胰島素受體底物等去磷酸化失活而發(fā)揮生理功能[1]。研究發(fā)現(xiàn)PTP1B的表達水平在糖尿病或發(fā)生胰島素抵抗時明顯升高。在嚙齒類糖尿病動物的骨骼肌和脂肪細胞中,PTP1B的表達和活性均顯著升高[2]。PTP1B基因敲除小鼠,與野生型小鼠相比,其胰島素敏感性增強,肝臟及肌肉組織中的胰島素受體磷酸化水平升高,該小鼠即使在致肥胖飲食條件下也不出現(xiàn)肥胖或胰島素抵抗[3]。這些研究提示PTP1B是胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負性調(diào)節(jié)者,PTP1B也就成為胰島素抵抗機制研究的重要位點[4]。

      吡格列酮屬于噻唑烷二酮類藥物(thiazolidilsdioms,TZDs),作為胰島素增敏劑,能有效降低2型糖尿病患者血糖和血漿胰島素水平,提示該藥不刺激胰島素的分泌,而是通過增強機體對胰島素的敏感性達到降低血糖的效果。目前認為其主要作用機制是通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體 γ(peroxisome proliferator-activated receptor -γ,PPARγ),調(diào)節(jié)某些參與葡萄糖和脂肪酸代謝的胰島素反應(yīng)性基因的轉(zhuǎn)錄[5]。吡格列酮如何改善骨骼肌胰島素敏感性具體機制目前還不確切,本研究對此進行初步探討。PPARγ在骨骼肌表達量很低,只有脂肪組織表達量的10%[6],因此以往認為脂肪組織是吡格列酮的主要作用位點,而骨骼肌胰島素作用改善是由于下調(diào)脂質(zhì)水平及減少葡萄糖脂肪循環(huán)引起的。然而骨骼肌胰島素敏感性改善非常明顯,而且TZD類藥物可以在成熟的骨骼肌細胞L6增加葡萄糖轉(zhuǎn)運[7]。TZD類藥物是否通過PPAR非依賴途徑增加肌肉胰島素敏感性?

      本研究用db/db糖尿病小鼠模型,觀察吡格列酮對其骨骼肌中PTP1B表達的影響,探討吡格列酮改善骨骼肌胰島素抵抗的分子機制。由于PTP1B是一種胞內(nèi)蛋白,目前還沒有定量檢測的方法,所以我們采用Western blot進行半定量蛋白檢測。實驗證實在胰島素抵抗狀態(tài)下,db/db小鼠骨骼肌PTP1B蛋白表達明顯增加。經(jīng)吡格列酮處理4周后db/db小鼠血糖下降,胰島素抵抗明顯改善,同時伴隨著骨骼肌PTP1B水平的下降。這提示PTP1B可能與吡格列酮改善骨骼肌胰島素敏感性有關(guān)。因此吡格列酮可能是通過減少PTP1B表達從而增加骨骼肌胰島素敏感性。但仍需大量進一步體外研究來證實該作用。下一步通過體外試驗研究吡格列酮對骨骼肌細胞PTP1B表達的影響及應(yīng)用PTP1B激動劑或抑制劑進行干預(yù),這有助于研究PTP1B在胰島素抵抗中的作用及吡格列酮作用機制。

      [1]Goldstein BJ,Bittner Kowalczyk A,White MF,et al.Tyrosine dephosphorylation and deactivation of insulin receptor substrate-1 by protein-tyrosine phosphatase 1B.Possible facilitation by the formation of a ternary complex with the Grb2 adaptor protein[J].JBiol Chem,2000,275(6):4283-4289.

      [2]Hirata AE,Alvarez-Rojas F,Carvalheira JB,et a1.Modulation of IR/PTP-1B interaction and downstream signaling in insulin sensitive tissues of MSG-rats[J].Life Sci,2003,73(11):1369 -1381.

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      [4]Ramachandran C,Kennedy BP.Protein tyrosine phosphatase 1B:a novel target for type 2 diabetes and obesity[J].Curr Top Med Chem,2003,3(7):749-757.

      [5]Kahn CR,Chen L,Cohen SE.Unraveling the mechanism of action of thiazolidinediones[J].JClin Invest.2000,106(11): 1305-1307.

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