β-環(huán)糊精衍生物流動(dòng)相添加劑應(yīng)用于HPCE中分離布洛芬

沈靜茹，朱財(cái)延，余學(xué)紅，韋慧慰，邱思楊

(1中南民族大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院分析化學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430074;2中南民族大學(xué)校醫(yī)院，武漢430074)

藥物布洛芬(結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1)在臨床上多以其外消旋體廣泛應(yīng)用，具有活性的是S體，而R-體無(wú)活性［1］，若以布洛芬的單一對(duì)映體給藥對(duì)提高藥效和降低潛在危害具有重要意義.布洛芬的分離分析方法包括萃取法［2］、高效液相色譜法［3，4］、高效毛細(xì)管電泳技術(shù)(HPCE)［5，6］以及聯(lián)用技術(shù)［7］等，大多以構(gòu)建手性分離環(huán)境實(shí)施.β-環(huán)糊精及其衍生物是常用的手性選擇劑［8-11］.前人以β-環(huán)糊精為手性選擇劑，在貝克曼HPCE儀上較弱地部分分離布洛芬［9］;或通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)方法將環(huán)糊精鍵合到固定相中分離布洛芬，但分離度 Rs僅0.50［10］;或利用帶有4-二甲氨基-1，8-萘二甲酰亞胺官能團(tuán)的環(huán)糊精衍生物通過(guò)開(kāi)環(huán)反應(yīng)制備手性整體柱，在HPCE條件下，12min內(nèi)基線分離布洛芬，Rs達(dá)2.26，此法的缺點(diǎn)是制柱過(guò)程復(fù)雜［11］.本文以雙-［6-氧-(2-間羧基苯磺酰基-丁二酸單酯-4)］β-CD(β-CD-B2)為HPCE流動(dòng)相手性添加劑，在硼砂緩沖液中分離布洛芬對(duì)映體，通過(guò)線性范圍考察該分析方法和它與手性藥物布比卡因的分離情況，為實(shí)現(xiàn)布洛芬單一對(duì)映體的分離分析提供條件.

圖1 布洛芬的結(jié)構(gòu)Fig.1 Stucture of ibuprofen

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效毛細(xì)管電泳儀(P/ACE MDQ，美國(guó)BECKMAN公司)，酸度計(jì)(pHs-3c型，上海偉業(yè)儀器廠)，熔融石英毛細(xì)管(75μm，ID，河北省永年光纖廠)，微孔濾膜(0.22μm，上海市新亞凈化器件廠).

β-環(huán)糊精(β-CD)、馬來(lái)酸酐、苯甲酸、丙酮、甲醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，氯磺酸(上海朝暉藥業(yè)有限公司)，布洛芬標(biāo)樣(含量99.5%，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，布洛芬片(江蘇平光制藥有限責(zé)任公司)，超純水和其他試劑均分析純.

1.2 藥品處理

將布洛芬溶于硼砂溶液作為樣品;另將不同濃度β-CD-B2溶于緩沖液中，并按分離需要調(diào)節(jié)不同的pH值作為流動(dòng)相.所有溶液均經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾.

1.3 HPCE分析前處理

每次運(yùn)行前先用水洗柱子3min，背景溶液洗3min.采用壓力進(jìn)樣，0.5psi進(jìn)樣 5s，分離電壓為25kV，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，溫度20℃.

1.4 β-CD-B2的合成

參照文獻(xiàn)［12］，首先將β-CD與馬來(lái)酸酐合成中間體β-CD-A2，之后與間羧基苯磺酰氯合成目標(biāo)產(chǎn)物 β-CD-B2.

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)比試驗(yàn)

在50mmol/L、pH8.0的硼砂緩沖液，其他條件同1.3，以純硼砂緩沖液分離布洛芬;并分別以濃度均為5g/L 的 β-CD、β-CD-A2、β-CD-B2為HPCE 流動(dòng)相添加劑分離布洛芬，結(jié)果見(jiàn)圖2.

圖2 加入不同手性添加劑時(shí)布洛芬的分離Fig.2 HPCE Separation of ibuprofen with different chiral additive

由圖2可見(jiàn)，純硼砂緩沖液和β-CD對(duì)布洛芬無(wú)手性分離跡象，且β-CD和β-CD-A2對(duì)藥物的洗脫強(qiáng)度較弱;β-CD-A2對(duì)布洛芬異構(gòu)體有分離跡象，因極性大對(duì)基線的影響較大且雜峰較多;β-CD-B2對(duì)布洛芬不僅洗脫強(qiáng)度大，且使手性異構(gòu)體達(dá)到了基線分離.說(shuō)明對(duì)β-環(huán)糊精進(jìn)行官能團(tuán)修飾后生成側(cè)鏈帶苯環(huán)的衍生物β-CD-B2，布洛芬結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)能與其產(chǎn)生腔體內(nèi)包合作用和π-π共軛.且2個(gè)對(duì)映體分子中含羧基官能團(tuán)與衍生物分子碳碳雙鍵、羧基、磺酸基團(tuán)等的氫鍵或共軛協(xié)同作用，使布洛芬兩手性異構(gòu)體與手性添加劑β-CD-B2的復(fù)合物在適宜的HPCE體系中產(chǎn)生足夠電荷差異，實(shí)現(xiàn)布洛芬手性異構(gòu)體的分離.

2.2 緩沖液pH值對(duì)手性分離布洛芬的影響

選取50mmol/L的硼砂緩沖溶液，β-CD-B2濃度為5g/L，其他條件同 1.3，改變緩沖液的 pH值(3.0，5.0，6.5，7.0，7.5，7.8，8.0，8.2，8.4，8.6，9.2，9.7，10.2)，考察 pH 值對(duì)布洛芬對(duì)映體分離的影響，結(jié)果見(jiàn)圖 3.由圖 3 可知，pH5.0 ～9.2，布洛芬對(duì)映體均可達(dá)到基線分離.當(dāng)緩沖液的pH＜5.0時(shí)，布洛芬無(wú)分離跡象，且基線波動(dòng)大;當(dāng)緩沖液pH≥5.0時(shí)，布洛芬對(duì)映體達(dá)到基線分離;隨著溶液pH的增大，后峰逐漸對(duì)稱，pH=8.0時(shí)，兩峰的對(duì)稱性和基線均相對(duì)適宜，兩峰的洗脫強(qiáng)度均較強(qiáng)，隨后兩峰對(duì)稱性有所減弱，響應(yīng)值也有所減小，即流動(dòng)相洗脫強(qiáng)度減弱;當(dāng)pH=9.7時(shí)，前峰消失，無(wú)法分離對(duì)映異構(gòu)體.緩沖液酸度變化影響布洛芬兩手性異構(gòu)體與β-CD-B2復(fù)合物表面的電荷量，布洛芬酸離解常數(shù)pKa=4.3［13］，故而在溶液pH大于布洛芬酸離解常數(shù)pKa的電場(chǎng)中，兩對(duì)映體保留時(shí)間差異逐漸加大，峰的洗脫強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，對(duì)稱性漸好，最終達(dá)到基線分離.故選取pH8.0為緩沖液的最佳分離pH值，最佳分離酸度范圍為pH5.0～9.2.

圖3 不同緩沖液pH下布洛芬的HPCE分離Fig.3 HPCE Separation of Ibuprofen under different pH buffer

2.3 硼砂緩沖液濃度對(duì)手性分離布洛芬的影響

在pH8.0的緩沖液中β-CD-B2濃度為5g/L，其他條件同 1.3，改變硼砂溶液濃度(20，30，40，50，60mmol/L)考察其對(duì)布洛芬的影響，結(jié)果見(jiàn)表1.由表1可見(jiàn)，硼砂緩沖液濃度在20～60mmol/L均可達(dá)到基線分離.當(dāng)緩沖液濃度為20mmol/L時(shí)，后峰響應(yīng)值較小，且有前伸現(xiàn)象;隨著緩沖液濃度的增大，后峰的洗脫強(qiáng)度逐漸加強(qiáng)，當(dāng)濃度為50mmol/L時(shí)達(dá)到最佳，且基線平穩(wěn)，Rs達(dá)4.26;當(dāng)濃度為60mmol/L時(shí)，分離效果與50mmol/L相當(dāng)，Rs略有下降，故選擇50mmol/L為分離布洛芬對(duì)映體的最佳硼砂緩沖液濃度.

表1 不同緩沖液濃度下布洛芬的分離Tab.1 Separation of Ibuprofen under the bufferwith different concentration

2.4 β-CD-B2濃度對(duì)布洛芬分離的影響

在pH8.0的緩沖液中，其他條件同1.3，改變?chǔ)?CD-B2濃度 ρ(2，3，4，5，6，7g/L)，考察其對(duì)布洛芬分離的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4.由圖4可見(jiàn)，當(dāng)β-CD-B2存在時(shí)，布洛芬對(duì)映體Rs＞2.5.當(dāng)ρ=2g/L時(shí)，后峰洗脫強(qiáng)度大，前峰太小且基線波動(dòng)大，兩峰對(duì)稱性較差;隨著β-CD-B2的濃度增大，前峰洗脫強(qiáng)度增大，兩峰對(duì)稱性逐漸增強(qiáng);當(dāng)ρ=5g/L時(shí)，對(duì)稱性及分離度均達(dá)到最佳;當(dāng)ρ=6g/L(或7g/L)時(shí) ，分離度均Rs≈4.0，幾近平臺(tái).故選取 5g/L 的 β-CD-B2為分離布洛芬對(duì)映體的最佳流動(dòng)相手性添加劑濃度.

圖4 不同手性添加劑用量對(duì)布洛芬分離的影響Fig.4 Separation of ibuprofen with different concentration of chiral additive

2.5 分離電壓對(duì)布洛芬分離的影響

在pH8.0的緩沖液中 β-CD-B2濃度為5g/L，其他條件同 1.3，改變分離電壓(10，15，20，25，30kV)，考察其對(duì)布洛芬分離的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5.由圖5可見(jiàn)，當(dāng)分離電壓為10kV(見(jiàn)圖5a)，兩峰出現(xiàn)分裂現(xiàn)象，呈非線性，后峰出峰時(shí)間長(zhǎng)，20min方完成;隨著電壓的升高，峰形逐漸對(duì)稱，出峰時(shí)間縮短(見(jiàn)圖5b，5c)，25kV 時(shí)最佳，分離度為4.26;當(dāng)分離電壓為30kV(見(jiàn)圖5d)也可分離，且分離時(shí)間縮短，但基線波動(dòng)稍大.故選取25 kV為分離布洛芬對(duì)映體的最佳分離電壓.

圖5 不同電壓下對(duì)布洛芬分離的影響Fig.5 Separation of ibuprofen under different voltage

2.6 線性范圍

在最佳HPCE分離條件下(50mmol/L硼砂緩沖液，pH8.0，β-CD-B2濃度5g/L，進(jìn)樣量為 0.5psi，5s，分離電壓25kV，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，分離溫度20℃)，以50mmol/L的硼砂為溶劑配制不同濃度的布洛芬標(biāo)準(zhǔn)品溶液，得到布洛芬對(duì)映體的電泳峰高、峰面積與濃度呈線性關(guān)系的結(jié)果見(jiàn)圖6.其中，前峰出現(xiàn)于布洛芬濃度為0.053～0.942mg/mL范圍內(nèi)，峰高-濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=10049.62679+4834.93635x，相關(guān)系數(shù) r=0.99564;峰面積-濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=87662.72919+43145.38656x，相關(guān)系數(shù)r=0.92265.后峰出現(xiàn)于布洛芬濃度為0.178 ～0.942mg/mL 范圍內(nèi)，峰高-濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=0.14698+9.78769 ×10－5x，相關(guān)系數(shù) r=0.96836;峰面積-濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=0.27099+9.74608 ×10－7x ，相關(guān)系數(shù) r=0.94263.由此可知，采用前峰的峰高-濃度可準(zhǔn)確定量，相關(guān)系數(shù)r=0.99564.略高于文獻(xiàn)氣質(zhì)聯(lián)用的方法［7］.

2.7 2種手性藥物的分離

藥物布比卡因［14］為長(zhǎng)效局麻藥，左旋體對(duì)中樞神經(jīng)及心臟的毒性明顯低于右旋體;布洛芬是抗炎鎮(zhèn)痛藥，若兩者能同時(shí)使用并分離可達(dá)到同時(shí)監(jiān)控外消旋體布比卡因和布洛芬兩對(duì)映異構(gòu)體的目的.制作模擬樣，將布洛芬溶液與布比卡因溶液混合，前者濃度為后者濃度的2倍，在分離布洛芬的最佳條件下，同時(shí)分離布洛芬與布比卡因，結(jié)果見(jiàn)圖6.經(jīng)定性研究確認(rèn)，同一分離電泳條件下，圖6(a)中的峰1為布洛芬的一個(gè)對(duì)映體;峰2為布比卡因且與圖6(b)中峰一致;峰3為布洛芬的另一個(gè)對(duì)映體.

圖6 布洛芬與布比卡因HPCE分離圖Fig.6 HPCE separation of ibuprofen and bupivacaine

3 結(jié)語(yǔ)

以 5g/L的 β-CD-B2為流動(dòng)相添加劑，50mmol/L硼砂為緩沖液，pH8.0，分離電壓 25kV，進(jìn)樣量0.5psi，5.0s，檢測(cè)波長(zhǎng) 254nm，溫度 20℃，在HPCE中分離布洛芬對(duì)映體，8min內(nèi)對(duì)映體基線分離，電泳峰對(duì)稱性最佳Rs為4.26.布洛芬對(duì)映體分離的前峰線性范圍為0.053～0.942g/L，后峰線性范圍為0.178～0.942g/L.在分離布洛芬的最佳條件下，可同時(shí)分離布洛芬兩對(duì)映異構(gòu)體與布比卡因外消旋體的混合溶液.

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