韓倩倩 王春仁 戴建武 魯葵 岳瑞齊 黃經(jīng)春

1 中國食品藥品檢定研究院（北京100050）

2 中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所（北京100190）

3 國家食品藥品監(jiān)督管理局濟南醫(yī)療器械監(jiān)督檢驗中心（濟南 250101）

1.功能生物材料概述

1.1 生物材料

生物材料通常指以醫(yī)療為目的，單獨或與藥物一起，用于組織或器官的治療或替代以修復受損組織的材料。使用生物材料的目的是為組織細胞生長提供三維支架，在對損傷部位進行填充、替換的同時，促進細胞的粘附、增殖乃至分化，所以除了符合一般生物醫(yī)學材料的要求外，理想的生物材料還需滿足以下要求：（1）良好的生物相容性；（2）可降解性及合適的降解速率；（3）合適的孔徑結構；（4）合適的表面理化性質和良好的細胞界面關系；（5）與植入部位組織的力學性能相匹配的結構強度；（6）便于加工成理想的二維或三維結構，可獲得所需的組織或器官形狀[2]。

1.2 膠原生物材料

膠原蛋白是細胞外基質的主要成分，作為細胞生長的依附與支架，能誘導上皮細胞等的增殖和分化。膠原蛋白為生物體提供了機械支撐作用，維護器官與組織的完整性，保障其正常功能的行使[3]。膠原在創(chuàng)傷修復中有十分重要的作用，是參與創(chuàng)傷愈合的主要結構蛋白，所以，我們選擇膠原作為修復組織損傷的支架材料。

膠原在醫(yī)學上的應用包括許多方面，包括創(chuàng)面的愈合和燒傷的修復、整形，神經(jīng)損傷再生，以及血管瓣膜替代等。表1 總結了膠原在醫(yī)療上的用途。

表1.膠原材料在醫(yī)療上的應用

2.功能膠原生物材料的研究

功能生物材料是指能主動對機體的理化或生理過程產生影響的生物活性材料，它能夠誘導細胞的長入，使材料細胞化，從而使得損傷部位形成新的組織。在這種情況下，生物材料不只是起物理機械支持作用，它還能夠通過改變周圍環(huán)境而改變再生的過程。目前，活化材料的生物活性分子有幾種：（1）促細胞粘附分子，促進細胞在材料上的生長和分化；（2）生長因子，促進細胞增殖、存活及控制細胞表型；（3）特異表達活性分子的DNA，可以達到長期穩(wěn)定的作用效果。三方面的研究目前都有很大的進展，我們更為關注生長因子的獨特功能。

2.1 生長因子與膠原復合構成生物材料

圖1.生長因子與材料簡單吸附的生物材料

生長因子是通過細胞間信號傳遞影響細胞活動的一類多肽因子，可由多種細胞分泌，與靶細胞表面的特異性受體結合來發(fā)揮其作用，有促進或抑制細胞的增殖、遷移和基因表達的作用，在生物體的發(fā)育與損傷修復過程中發(fā)揮重要的作用[4]。

目前，用生長因子來活化膠原材料，并與膠原材料聯(lián)合用于損傷修復的例子已經(jīng)有很多。然而，根據(jù)目前的研究，生長因子與生物材料簡單的復合作用是有限的，這是因為體內體液的浸潤與流動，造成了生長因子的自由擴散，從而不能達到局部富集的目的。如圖1 所示。這種擴散會有幾方面的問題，一是擴散的生長因子為機體帶來潛在的風險，二是擴散使細胞活動主要發(fā)生在材料的外部，導致修復效果有限，而為了加強修復效果，需要反復用藥，這無疑增加了成本與患者的痛苦[5]。

2.2 利用帶膠原結合區(qū)的生長因子與膠原材料復合構成功能膠原生物材料

如果通過特定的方式，將生長因子錨定在膠原支架材料上，限制生長因子的自由擴散，就能使生長因子在材料的原位發(fā)揮作用，促進細胞在材料內的增殖、遷移、分化。如圖2 所示。由此我們可以預測：一方面，移植到體內后，生長因子的自由擴散可以得到限制，削弱生長因子的自由擴散對機體的潛在風險；另一方面，可以大大降低生長因子使用量，降低治療成本，達到高效率利用生長因子的目的；最重要的一點是可以提高修復治療效率，使得再生能夠比較均勻，從而提高修復后組織的質量[5]。

為了增強生長因子與膠原材料的結合能力，采用基因工程的方法，在生長因子上融合能夠特異結合膠原的多肽TKKTLRT（膠原結合區(qū)CBD），從而賦予生長因子更強的特異結合膠原蛋白的能力。其中，膠原結合區(qū)CBD 衍生于膠原酶中膠原結合區(qū)的一段7 肽，序列為TKKTLRT，具有特異的膠原結合能力。

針對不同的損傷，可以制備不同的膠原材料。對適于這種組織損傷修復的生長因子進行改造，使之帶有膠原結合能力。具有膠原特異結合能力的生長因子和不同的膠原材料，構成適于不同組織損傷修復的功能膠原生物材料，并且在皮膚、骨、肌肉（膀胱肌肉，腹壁肌肉）、外周神經(jīng)和中樞神經(jīng)損傷修復中驗證了膠原功能生物材料的作用。

圖 2.生長因子與材料定向結合的功能生物材料

3.膠原功能生物材料對不同組織損傷修復的作用

3.1 膠原功能生物材料在皮膚組織損傷修復中的作用

對于皮膚損傷修復，膠原膜(Collagen Membrane,CM)是一種合適的材料。膠原膜可以作為創(chuàng)面覆蓋物，具有封閉創(chuàng)面、保濕、止血以及可吸收等特點（圖3）。

選擇PDGF-BB（血小板源性生長因子-BB）作為治療皮膚損傷的活化因子。PDGF 參與了許多細胞活動，包括細胞增殖、細胞生長、遷移及細胞的生存凋亡等，對各種間充質及神經(jīng)上皮來源的一些細胞是潛在的促分裂素。大量的動物實驗表明，加入外源的PDGF 能夠促進愈合過程。外源PDGF-BB 能夠促進組織的新生、傷口的愈合，提高修復質量[6,7]。

對PDGF-BB 進行改造，將膠原結合區(qū)CBD融合入PDGF-BB 中，制備出帶膠原結合區(qū)的PDGF-BB（稱之為CBD-PDGF），同時也制備出天然形式的PDGF-BB，稱之為NAT-PDGF。體外細胞實驗的結果表明，NAT-PDGF 和CBD-PDGF具有相似的生物學活性，這說明膠原結合區(qū)CBD的融合，沒有影響CBD-PDGF 的生物學活性[7]。體外膠原結合實驗的結果顯示，CBD-PDGF 具有特異結合膠原蛋白的能力，其膠原結合能力顯著性優(yōu)于NAT-BDNF[7]。

隨后，用動物模型檢驗由膠原膜結合CBDPDGF 構成的功能膠原生物材料。采用的皮膚損傷模型是兔耳潰瘍模型。共分為3 組：PBS 浸泡的膠原膜組（CM/PBS），膠原膜吸附NAT-PDGF組（CM/NAT-PDGF），膠原膜結合CBD-PDGF 組(CM/CBD-PDGF)。測量不同時間點，各個組的傷口愈合率，結果顯示，由膠原膜結合CBD-PDGF構成的功能膠原生物材料組的愈合速度顯著好于膠原膜吸附NAT-PDGF 組和對照組。手術后14 天，由膠原膜結合CBD-PDGF 構成的功能生物材料組的潰瘍已經(jīng)基本愈合。免疫組化觀察血管新生和膠原沉積。血管新生將改變傷口處的血供，運輸養(yǎng)分；而膠原沉積是皮膚愈合及重塑不可或缺的過程，膠原沉積的好壞往往反映了傷口愈合治療的優(yōu)劣。在這兩個指標上，由膠原膜結合CBDPDGF 構成的功能膠原生物材料組也顯著高于膠原膜吸附NAT-PDGF 組與對照組，顯示了其在促進損傷修復，提高修復質量上的巨大作用[7]。

圖3.膠原膜（CM）的結構（A）膠原膜（CM）的直觀圖（B）膠原膜（CM）電鏡圖

圖4.DBM的結構（A）DBM直觀圖；（B）DBM電鏡圖。

3.2 膠原功能生物材料在骨組織損傷修復中的作用

選擇脫鈣骨基質(Demineral bone matrix,DBM)即骨膠原作為促進骨損傷修復的支架材料（圖4）。DBM 保持了天然骨的小梁結構與有機成分（骨的主要成分），DBM 的膠原結構表面含有礦物沉積的位點，對礦物沉積有誘導作用，可有效引發(fā)和控制礦化過程，促進骨形成，因而是很好的骨填充材料[5,8]。

研究的另外一個方面是選擇活化DBM 的因子，研究人員選擇了骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)作為誘導骨形成的活性分子。同樣，通過基因工程的方法在BMP-2 一端耦聯(lián)CBD，制備出與膠原蛋白具有特異結合能力的CBD-BMP-2。且制備出天然的BMP-2（NAT-BMP-2）。體外細胞實驗驗證了NAT-BMP-2 與CBD-BMP-2 的生物學活性沒有明顯的差別，體外膠原結合實驗的結果表明CBD-BMP-2 具有良好的膠原結合能力[5]。

為了研究這種功能膠原生物材料對原位骨缺損的修復作用，采用兔下頜骨缺損模型，即在兔的下頜骨部位制造一個自身無法修復的12mm×5mm×4mm 的缺損。隨后用3 組不同材料填充，或不填充作為對照，即總共分為4 個組：不填充材料的空白組，填充PBS 浸泡的DBM 作為對照組（DBM/PBS），以及 DBM 吸附NAT-BMP-2組（DBM/NAT-BMP-2），DBM 結合CBD-BMP-2組（DBM/CBD-BMP-2）。對不同組的愈合情況進行X 光檢查，通過側面的X 光成像來分析傷口的愈合情況。結果表明由DBM 結合CBD-BMP-2 構成的功能膠原生物材料（DBM/CBD-BMP-2）顯著加速了骨修復的能力，不僅外周成骨比較成熟，而且材料的內部的成骨作用也非常明顯[5]。

3.3 功能膠原生物材料在肌肉組織損傷修復中的作用

3.3.1 膀胱肌肉損傷修復

用膠原膜CM 作為促進膀胱肌肉損傷修復的支架材料。選擇人堿性成纖維生長因子bFGF 作為活化材料的因子。bFGF 是促進膀胱損傷后組織再生的重要因子。對bFGF 進行改造，將膠原結合區(qū)CBD 融合入bFGF 蛋白中，制備出能與膠原蛋白特異結合的CBD-bFGF，同時也制備出天然形式的bFGF（NAT-bFGF）。在大鼠膀胱肌肉損傷模型中，檢驗了由膠原膜結合CBD-bFGF構成的功能膠原生物材料的作用。共分為4 組：假手術組（sham-operated group）；PBS 浸泡過的膠原膜組（CM/PBS）；膠原膜吸附NAT-bFGF 組（CM/NAT-bFGF）；膠原膜結合CBD-bFGF 組（CM/CBD-bFGF）[9]。

修復過程中的30 天和90 天兩個時間點，H&E 染色觀察各組損傷修復的直觀情況。結果表明，由膠原膜結合CBD-bFGF 構成的功能膠原生物材料組的材料植入處細胞化明顯高于其他治療組，且90 天時，其損傷部位再生組織的形態(tài)與正常組織相似。損傷處平滑肌細胞的免疫組化染色結果也表明，由功能膠原生物材料組材料植入處平滑肌細胞的陽性率顯著高于其他治療組，說明它能夠促進損傷部位肌肉損傷的修復。接著，進行尿動力學檢測，觀察各組膀胱功能的恢復情況。結果表明，功能膠原生物材料組的膀胱順應性，即膀胱肌肉的彈性性能明顯高于其他組，這說明由膠原膜結合CBD-bFGF 構成的功能膠原生物材料，顯著促進了受損膀胱肌肉再生及膀胱功能的恢復[9]。

3.3.2 腹壁肌肉損傷修復

采用大鼠腹壁肌肉缺損模型檢驗了對膀胱肌肉損傷修復有效果的膠原膜結合CBD-bFGF 構成的功能膠原生物材料。腹壁肌肉缺損處用材料覆蓋，共分為四組：經(jīng)PBS 浸泡的膠原膜組（CM/PBS）；膠原膜結合吸附NAT-BDNF 組（CM/NAT-BDNF）；膠原膜結合CBD-BDNF 組（CM/CBD-BDNF）；假手術組（sham）?；謴?0 天后，腹壁損傷處H&E 染色和平滑肌細胞免疫組化染色的結果表明，collagen/CBD-bFGF 組損傷處平滑肌細胞陽性率顯著高于其他治療組。說明，這種由膠原膜結合CBD-bFGF 構成的功能膠原生物材料促進了腹壁肌肉缺損處的肌肉再生[10]。觀察再生的腹壁肌肉組織的機械性能以評價再生腹壁肌肉組織的功能恢復，測定了再生腹壁肌肉的機械抗拉力性能。結果表明，collagen/CBD-bFGF組的最大彈性性能顯著好于其他治療組，說明由膠原膜結合CBD-bFGF 構成的功能膠原生物材料促進了再生肌肉的功能恢復[10]。

3.4 膠原功能生物材料在外周神經(jīng)損傷修復中的作用

對于外周神經(jīng)損傷的修復，選用膠原膜CM作為支架材料。同時，選用神經(jīng)營養(yǎng)因子（NGF）作為活化膠原膜，促進外周神經(jīng)再生的因子。NGF 的生物學效應廣泛，主要通過促進神經(jīng)細胞樹狀突發(fā)生、伸展和維持存活的作用，增加神經(jīng)纖維在支配靶區(qū)的密度，并且促進神經(jīng)細胞的分化，加快有絲分裂，使神經(jīng)細胞數(shù)目增加，決定軸突的生長方向[11]。

對NGF 進行改造，使之帶有膠原結合區(qū)CBD，制備出能與膠原特異結合的NGF（CBDNGF），同時制備出天然的NGF（NAT-NGF）。體外細胞活性實驗表明CBD-NGF 和NAT-NGF 都具有神經(jīng)營養(yǎng)活性，促使pc12 細胞生長出軸突。膠原結合實驗也表明，CBD-NGF 具有特異的膠原結合能力。采用大鼠皮下包埋實驗觀察由膠原膜結合CBD-BDNF 構成的功能膠原生物材料促進外周神經(jīng)再生的效果。共分為三組：PBS 浸泡膠原膜的對照組；膠原膜吸附NAT-NGF 組；膠原膜結合CBD-NGF 組。這三個組之間的神經(jīng)纖維數(shù)目都具有顯著性差異。其中由膠原膜結合CBD-NGF 構成的功能膠原生物材料組的神經(jīng)纖維數(shù)目要明顯高于另外兩組?？梢缘贸鼋Y論，由膠原膜結合CBD-NGF 構成的功能膠原生物材料能夠有效促進外周神經(jīng)再生[11]。

3.5 膠原功能生物材料在中樞神經(jīng)損傷修復中的作用

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一類致殘率很高的中樞神經(jīng)損傷。其中比較嚴重的是脊髓斷裂損傷，其損傷部位神經(jīng)絲斷開連接，受損脊髓組織甚至出現(xiàn)缺損。斷裂傷后神經(jīng)再生面臨的障礙有：（1）損傷處缺乏促進軸突生長的因子；（2）軸突生長缺乏方向性，難以實現(xiàn)正確的突觸連接，神經(jīng)功能很難恢復。針對這些問題，需要設計一個綜合的治療策略，克服再生障礙。（1）要選擇一種良好的神經(jīng)生長引導材料；（2）對材料進行修飾，使之帶有活性成分，促進軸突生長。

良好的軸突生長引導材料可以引導受損軸突的生長方向，使之形成正確的突觸聯(lián)接，促進神經(jīng)功能恢復。采用有序膠原生物材料LOCS（圖5）[12]。其次，選擇腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）作為活化LOCS，促進神經(jīng)再生的因子。BDNF 能夠促進神經(jīng)元的存活與分化，常被用來治療中樞神經(jīng)損傷，包括帕金森癥、抑郁癥及脊髓損傷[13]。研究人員對BDNF 進行改造，將膠原蛋白結合區(qū)CBD 融合入BDNF 蛋白，制備出能與膠原材料特異結合的BDNF（CBD-BDNF），同時，還制備出天然形式的BDNF（NAT-BDNF）[12]。

圖5.有序膠原材料LOCS的宏觀照片（a）-（c）及電鏡照片（d）

采用大鼠脊髓半橫斷損傷模型檢驗了由LOCS 結合CBD-BDNF 構成的功能膠原生物材料的作用。大鼠脊髓做6mm 長半橫斷損傷，材料縱向植入脊髓缺損處，分為四組：對照組，不植入材料；LOCS 組；LOCS 吸附NAT-BDNF 組；LOCS 結合CBD-BDNF 組。

BBB 行為學評分結果表明，LOCS 結合CBDBDNF 組的運動能力恢復顯著好于其他組。免疫組化觀察材料植入部位的神經(jīng)再生情況：神經(jīng)絲NF 染色結果表明，LOCS 結合CBD-BDNF 組的神經(jīng)絲陽性率顯著高于其他組，且軸突再生方向與其他組比較有更好的有序性。說明LOCS 結合CBD-BDNF 所構成的功能膠原生物材料不但能促進神經(jīng)再生，而且能引導軸突沿LOCS 的方向有序生長，顯著促進了脊髓損傷大鼠的運動能力恢復。

4.結論

針對不同的組織損傷，可以選用不同的膠原材料作為促進再生的支架材料：膠原膜CM 適用于皮膚、肌肉、外周神經(jīng)的損傷修復；脫鈣骨膠原DBM 適用于骨組織修復；有序膠原材料LOCS 適用于脊髓中樞神經(jīng)損傷的修復。同時，用帶膠原結合區(qū)的生長因子來活化膠原材料，構成功能膠原生物材料，促進不同組織損傷的再生：CBD-PDGF 用于活化膠原膜，促進皮膚損傷再生；CBD-BMP-2 用于活化脫鈣骨膠原DBM，促進骨損傷修復；CBD-bFGF 用于活化膠原膜，促進肌肉損傷修復；CBD-NGF 用來活化膠原膜，用于外周神經(jīng)損傷修復；CBD-BDNF 用來活化有序膠原材料LOCS，用于脊髓中樞神經(jīng)損傷修復。采用不同的組織損傷大鼠模型檢驗了這些膠原功能生物材料促進相關組織損傷修復的作用。結果表明，通過限制生長因子在生物材料上的擴散可以有效提高生物材料引導組織再生的能力。

[1]Peppas NA,Langer R(1994)New challenges in biomaterials.Science 263:1715-1720.

[2]Langer R,Vacanti JP(1993)Tissue engineering.Science 260:920-926.

[3]Gelse K,Poschl E,Aigner T(2003)Collagens--structure,function,and biosynthesis.Adv Drug Deliv Rev 55:1531-1546.

[4]Macri L,Silverstein D,Clark RA(2007)Growth factor binding to the pericellular matrix and its importance in tissue engineering.Adv Drug Deliv Rev 59:1366-1381.

[5]Chen B,Lin H,Wang J,Zhao Y,Wang B,et al.(2007)Homogeneous osteogenesis and bone regeneration by demineralized bone matrix loading with collagen-targeting bone morphogenetic protein-2.Biomaterials 28:1027-1035.

[6]Heldin CH,Westermark B(1999)Mechanism of action and in vivo role of platelet-derived growth factor.Physiol Rev 79:1283-1316.

[7]Lin H,Chen B,Sun W,Zhao W,Zhao Y,et al.(2006)The effect of collagen-targeting platelet-derived growth factor on cellularization and vascularization of collagen scaffolds.Biomaterials 27:5708-5714.

[8]Chakkalakal DA,Strates BS,Garvin KL,Novak JR,Fritz ED,et al.(2001)Demineralized bone matrix as a biological scaffold for bone repair.Tissue Eng 7:161-177.

[9]Chen W,Shi C,Yi S,Chen B,Zhang W,et al.Bladder regeneration by collagen scaffolds with collagen binding human basic fibroblast growth factor.J Urol 183:2432-2439.

[10]Shi C,Chen W,Zhao Y,Chen B,Xiao Z,et al.Regeneration of full-thickness abdominal wall defects in rats using collagen scaffolds loaded with collagen-binding basic fibroblast growth factor.Biomaterials.

[11]Sun W,Lin H,Chen B,Zhao W,Zhao Y,et al.(2007)Promotion of peripheral nerve growth by collagen scaffolds loaded with collagen-targeting human nerve growth factor-beta.J Biomed Mater Res A 83:1054-1061.

[12]Han Q,Sun W,Lin H,Zhao W,Gao Y,et al.(2009)Linear ordered collagen scaffolds loaded with collagen-binding brainderived neurotrophic factor improve the recovery of spinal cord injury in rats.Tissue Eng Part A 15:2927-2935.

[13]Sharma HS,Nyberg F,Westman J,Alm P,Gordh T,et al.(1998)Brain derived neurotrophic factor and insulin like growth factor-1 attenuate upregulation of nitric oxide synthase and cell injury following trauma to the spinal cord.An immunohistochemical study in the rat.Amino Acids 14:121-129.