崔艷紅 韓慶功 ???魏龍龍 張貝貝 胡志明
(河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003)
木質(zhì)素是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜且穩(wěn)定的生物大分子物質(zhì),在秸稈類物質(zhì)中約占20%,其產(chǎn)量僅次于纖維素。由于動(dòng)物體內(nèi)缺乏降解木質(zhì)素的酶類,因此很難將其作為有效的飼料來源。自然界中,木質(zhì)素的完全降解是真菌、細(xì)菌、放線菌及相應(yīng)微生物群落共同作用的結(jié)果,其中真菌起著主導(dǎo)作用。趙紅霞等(2002)[1]報(bào)道,在適宜的條件下,白腐真菌的菌絲首先利用其分泌的超纖維素酶溶解表面的蠟質(zhì),然后菌絲進(jìn)入秸稈內(nèi)部,并產(chǎn)生錳過氧化物酶(MnP)、木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)、纖維素酶、半纖維素酶,降解秸稈中的木質(zhì)素和纖維素,其中起關(guān)鍵作用的是LiP和MnP。目前,關(guān)于木質(zhì)素降解酶的研究主要集中于白腐真菌,其對(duì)木質(zhì)素的降解主要通過分泌胞外降解酶完成,主要有3種:①木質(zhì)素過氧化物酶(Lignin peroxidase,LiP);②錳過氧化物酶(Manganese peroxidase,MnP);③漆酶(1accase,Lac)[2]。
木質(zhì)層孔菌(F.lignosus)是白腐真菌的一種,產(chǎn)生的胞外酶有木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)、錳過氧化物酶(MnP)、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、漆酶等氧化酶類。Pease等[3]報(bào)道,錳過氧化物酶對(duì)木質(zhì)素的降解起關(guān)鍵作用。據(jù)調(diào)查,目前在研究木質(zhì)素降解酶的領(lǐng)域?qū)﹀i過氧化物酶研究尚少,而且大多集中在黃孢原毛平革菌和變色栓菌中的錳過氧化物酶。董旭杰等(2006)[4]研究指出,將3種白腐菌產(chǎn)錳過氧化物酶的能力進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)木質(zhì)層孔菌產(chǎn)錳過氧化物酶量最高,可達(dá)880.2 U/l。
MnP是一種含鐵血紅素的糖基化過氧化物酶,在Mn2+和H2O2存在時(shí),MnP能氧化分解芳香環(huán)多聚體,被認(rèn)為是木質(zhì)素降解的關(guān)鍵酶之一。相對(duì)于其它過氧化物酶,MnP的特別之處在于它的底物是有機(jī)酸。其可以氧化Mn2+為Mn3+,而Mn3+可以鰲合有機(jī)酸,這種鰲合物可通過擴(kuò)散離開酶活性中心,去催化氧化二級(jí)底物,如酚化合物、木質(zhì)素相關(guān)復(fù)合物及大分子量氯代木質(zhì)素、氯代酚和許多其它物質(zhì)。其對(duì)木質(zhì)素的降解有賴于大量穩(wěn)定的Mn3+的存在,與其他酶一起能把木質(zhì)素徹底降解為CO2。因?yàn)镸nP的底物專一性弱,具有氧化降解各類芳香族化合物的獨(dú)特能力,因此,在紙漿的生物漂白、有機(jī)污染物的降解、染料的脫色、褐煤的生物降解、農(nóng)業(yè)廢棄物的處理和催化聚合反應(yīng)等方面得到了較多的研究與應(yīng)用[5]。
本試驗(yàn)選用白腐真菌中能產(chǎn)生較高錳過氧化物酶的菌株木質(zhì)層孔菌5.132,研究了不同溫度、碳源、氮源和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株5.132產(chǎn)錳過氧化物酶的影響,以確定其最佳培養(yǎng)條件,并對(duì)錳過氧化物酶的部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究,為錳過氧化物酶的高效利用奠定基礎(chǔ)。
1.1.1 菌種
木質(zhì)層孔菌[Fomes lignosus(Berk)Coke],購自中國科學(xué)院微生物研究所,河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院營養(yǎng)教研室保存。
1.1.2 培養(yǎng)基
PDA固體培養(yǎng)基:馬鈴薯提取液1 000 ml、葡萄糖20.0 g、瓊脂15.0 g;
PDA液體培養(yǎng)基:馬鈴薯提取液1 000 ml、葡萄糖20.0 g。
1.1.3 儀器設(shè)備
電熱蒸餾水器(北京市光明醫(yī)療儀器廠),數(shù)顯超級(jí)恒溫水浴鍋(金壇市瑞爾電器有限公司),電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司),SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司),722型光柵分光光度計(jì)(山東高密分析儀器廠),分析天平AB240-N(上海梅特勒-托利多儀器有限公司),電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器有限公司),802-型離心機(jī)(江蘇金壇大地自動(dòng)化儀器廠)。
1.2.1 孢子懸液的制備
將木質(zhì)層孔菌接種于滅菌后的斜面PDA固體培養(yǎng)基上活化,向培養(yǎng)5 d的斜面試管內(nèi)加入無菌水,將菌絲洗出到三角瓶內(nèi),加玻璃珠打碎后,進(jìn)行孢子計(jì)數(shù)。然后接入到250 ml三角瓶中,三角瓶裝液量50 ml、接種量0.2 ml(以孢子計(jì)1.0×106個(gè)/ml)。
1.2.2 粗酶液制備
取木質(zhì)層孔菌液體培養(yǎng)物于離心管中,3 000 r/min離心10 min,上清液即為粗酶液。
1.2.3 錳過氧化物酶活力測(cè)定
Mn3+是MnP作用的直接產(chǎn)物,在238 nm處測(cè)Mn3+的吸光值是測(cè)定MnP活力的一個(gè)較為靈敏簡(jiǎn)便的方法,此方法稱乳酸鈉法。乳酸鈉法還可用于連續(xù)測(cè)定,具體步驟為:在4 ml反應(yīng)體系中含50 mmol/l(pH值4~5)的乳酸鈉緩沖液3.4 ml、1.6 mmol/l的硫酸錳溶液0.1 ml、粗酶液0.4 ml,預(yù)熱至37℃時(shí),加1.6 mmol/l的H2O2溶液0.1 ml啟動(dòng)反應(yīng)。在238 nm紫外光處,測(cè)定反應(yīng)4 min內(nèi)的吸光光度值(OD)。在對(duì)照組中,以煮沸滅活15 min酶液代替原酶液,以蒸餾水代替H2O2溶液,其他反應(yīng)物不變。錳過氧化物酶活力定義為每分鐘使1 μmo1/l的Mn2+轉(zhuǎn)化為Mn3+所需的酶量為1個(gè)酶活力單位(U/l)。
2.1.1 培養(yǎng)溫度對(duì)木質(zhì)層孔菌產(chǎn)錳過氧化物酶的影響
將分裝好的基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基高壓滅菌后,加入5.132孢子懸液,分別在20、25、30、35、40、45℃的恒溫條件下培養(yǎng),培養(yǎng)5 d后測(cè)定酶活,結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出,木質(zhì)層孔菌在25~30℃范圍內(nèi)產(chǎn)酶量急劇上升,在30~35℃范圍內(nèi)產(chǎn)酶量增加緩慢并達(dá)到高峰為185~215 U/l。35℃時(shí)的產(chǎn)酶量是25℃
時(shí)產(chǎn)酶量的2.5倍,溫度高于35℃時(shí)產(chǎn)酶量開始下降,到45℃時(shí)產(chǎn)酶量為70 U/l,與低溫狀態(tài)下的產(chǎn)酶量幾乎無差異。綜合比較,35℃為木質(zhì)層孔菌合成錳過氧化物酶的最佳培養(yǎng)溫度,溫度過高或過低都不利于酶的合成。
2.1.2 不同碳源對(duì)木質(zhì)層孔菌產(chǎn)錳過氧化物酶的影響
本試驗(yàn)在基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別選用不同的碳源:葡萄糖(單糖)、蔗糖(二糖)、可溶性淀粉(多糖)、麩皮和小麥秸粉各1.5 g/100 ml,分別接入菌種,靜置培養(yǎng)至第5 d測(cè)定酶活力,發(fā)現(xiàn)酶活力隨不同碳源而異,如圖2所示。
由圖2結(jié)果可知,麩皮和小麥秸粉最適于木質(zhì)層孔菌產(chǎn)錳過氧化物酶,酶活力分別高達(dá)578.4 U/l和620.7 U/l,產(chǎn)量高于其他碳源。所以,在5種碳源中,對(duì)木質(zhì)層孔菌錳過氧化物酶合成最有利的是小麥秸粉,其次是麥麩,接下來依次為可溶性淀粉、葡萄糖和蔗糖。
2.1.3 不同氮源對(duì)木質(zhì)層孔菌產(chǎn)錳過氧化物酶的影響
本試驗(yàn)在100 ml PDA基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中加小麥秸粉1.5 g做碳源,然后分別加尿素、草酸銨、氯化銨、胰蛋白胨、牛肉膏各0.5 g,接種木質(zhì)層孔菌,培養(yǎng)5 d后進(jìn)行酶活力測(cè)定,考察不同氮源對(duì)木質(zhì)層孔菌產(chǎn)錳過氧化物酶的影響,結(jié)果見圖3。
由圖3可看出,木質(zhì)層孔菌在5種不同氮源培養(yǎng)條件下均有錳過氧化物酶的合成,但錳過氧化物酶產(chǎn)酶活力的差異比較大。氮源為胰蛋白胨時(shí),錳過氧化物酶的活力最高,為680.5 U/l;以尿素為氮源時(shí)的錳過氧化物酶活力為650.3 U/l,與胰蛋白胨為氮源時(shí)相比酶的活力稍微下降。以牛肉膏為氮源時(shí),錳過氧化物酶的活力為458.9 U/l;以氯化銨為氮源時(shí),錳過氧化物酶的活力為369.7 U/l;以草酸銨為氮源時(shí),錳過氧化物酶的活力最低,為320.5 U/l。由此可見,以胰蛋白胨為氮源時(shí)的錳過氧化物酶的活力最高,尿素次之,隨后為牛肉膏、氯化銨和草酸銨。
2.1.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)木質(zhì)層孔菌產(chǎn)錳過氧化物酶的影響
用基礎(chǔ)液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)木質(zhì)層孔菌,每隔24 h測(cè)酶活力,連測(cè)10 d以考察不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)木質(zhì)層孔菌合成錳過氧化物酶的影響,結(jié)果如圖4。
由圖4可知,木質(zhì)層孔菌產(chǎn)錳過氧化物酶的量隨時(shí)間的延長而平穩(wěn)上升,在120 h時(shí)出現(xiàn)一個(gè)產(chǎn)酶高峰,酶活力為938 U/l。此高峰過后,酶活力稍有下降,并在192 h時(shí)酶活力突然升高,此階段為測(cè)定期間的酶活最高峰值,酶活力高達(dá)1 180.3 U/l,高峰過后錳過氧化物酶的活力大幅度下降。
2.2.1 酶作用最適溫度
分別將優(yōu)化條件下提取的粗酶液在32、37、42、47、52、57、62℃進(jìn)行酶解反應(yīng),測(cè)定不同溫度下錳過氧化物酶的相對(duì)活力(原粗酶液相對(duì)酶活為100%),結(jié)果見圖5。
一般而言,在酶沒有發(fā)生變性之前,其酶活會(huì)隨反應(yīng)溫度的增加而增強(qiáng),從圖5中的曲線圖可以看出,在32~47℃溫度范圍內(nèi),錳過氧化物酶的相對(duì)酶活隨溫度的升高而逐漸增大,在52℃時(shí),相對(duì)酶活達(dá)到最大,繼續(xù)升高溫度,錳過氧化物酶的相對(duì)酶活呈快速下降趨勢(shì),說明溫度高于52℃時(shí)會(huì)導(dǎo)致錳過氧化物酶發(fā)生部分結(jié)構(gòu)的變性,從而導(dǎo)致相對(duì)酶活大大降低。
2.2.2 酶作用最適pH值
真菌在酸性條件下木質(zhì)素降解酶活性最高,但不同的菌種有不同的最適pH值范圍。將提取的粗酶液分別于pH值3.5、4.0、4.5、5.0、5.5的50 mmol/l醋酸-醋酸鈉緩沖液中進(jìn)行酶解反應(yīng),測(cè)定不同pH值情況下的相對(duì)酶活力,結(jié)果如圖6所示。
圖6結(jié)果顯示,木質(zhì)層孔菌產(chǎn)錳過氧化物酶和大多數(shù)白腐真菌木質(zhì)素降解酶系一樣,有相對(duì)狹窄的最佳pH值范圍。錳過氧化物酶在pH值4~5范圍內(nèi)酶活力比較穩(wěn)定,其相對(duì)酶活力均能維持在70%以上,并在pH值4.5時(shí)相對(duì)酶活力最高,達(dá)89%。
2.2.3 金屬離子對(duì)酶作用特性的影響
本試驗(yàn)在粗酶液中分別加入1 mmol/l的CuSO4·5H2O、MgSO4、FeSO4·7H2O、CaCl2、ZnSO4、AgNO3各1 ml,考察在不同金屬離子存在的條件下錳過氧化物酶的相對(duì)酶活力,結(jié)果如圖7所示。
由圖7可知,在有Zn2+和Ca2+存在的環(huán)境下,錳過氧化物酶的相對(duì)酶活力大于100%,其對(duì)MnP的活性有促進(jìn)作用;Mg2+存在的環(huán)境中相對(duì)酶活達(dá)98.7%,對(duì)MnP的活力影響不是很大;而在Cu2+、Fe2+和Ag+存在的環(huán)境下,可使錳過氧化物酶的相對(duì)活力下降,對(duì)錳過氧化物酶活力具有抑制作用,其中Fe2+的抑制作用最強(qiáng)。
碳源是構(gòu)成菌體碳架及能量的來源,真菌細(xì)胞干重的一半是由碳組成的,由此可見,碳源在真菌生長過程中占有很重要的地位。小麥秸粉作為最佳碳源,其錳過氧化物酶的產(chǎn)量與以麩皮為碳源時(shí)的產(chǎn)量相差不大,比以可溶性淀粉為碳源時(shí)高1.6倍,比以葡萄糖為碳源時(shí)高1.8倍,比以蔗糖為碳源時(shí)高2.3倍。本試驗(yàn)結(jié)果與楊曉寬等(2004)[6]報(bào)道的白腐菌產(chǎn)錳過氧化物酶最佳碳源為葡萄糖的試驗(yàn)結(jié)果不一致,有待進(jìn)一步的研究。
氮源是合成菌體蛋白、核酸等含氮物質(zhì)的重要組成成分。不同氮源對(duì)真菌菌絲體的生長有不同程度的促進(jìn)作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明,以胰蛋白胨為氮源時(shí)的錳過氧化物酶活力最高,尿素次之,隨后為牛肉膏、氯化銨和草酸銨。由此可推出有機(jī)氮源比無機(jī)氮源更有利于錳過氧化物酶的合成,但考慮到蛋白胨實(shí)際含氮量不恒定,并且利用尿素代替胰蛋白胨為氮源,可節(jié)約生產(chǎn)成本,更有利于工業(yè)化生產(chǎn)。此試驗(yàn)結(jié)果與董旭杰等[7]報(bào)道的木質(zhì)層孔菌產(chǎn)錳過氧化物酶的氮源優(yōu)劣順序相似。
在培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響中,試驗(yàn)結(jié)果顯示,隨培養(yǎng)時(shí)間延長酶量逐漸提高,培養(yǎng)至第5 d時(shí)出現(xiàn)一個(gè)產(chǎn)酶高峰,之后有所下降,至第8 d又出現(xiàn)一個(gè)產(chǎn)酶高峰,之后酶活力大幅度下降。分析在最初培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)主要用于菌株的生長,所以酶活力比較低,隨菌體的生長,其產(chǎn)酶量開始上升,并在第8 d達(dá)到最高峰為1 180.3 U/l,之后,菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期,隨著營養(yǎng)物質(zhì)的消耗,黏度上升,溶氧不足,酶活開始下降。
酶的溫度耐受性和其本身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有很大關(guān)系,在不同溫度條件下酶反應(yīng)速率也大不相同。從試驗(yàn)結(jié)果和實(shí)際生產(chǎn)的角度考慮,52℃為木質(zhì)層孔菌產(chǎn)錳過氧化物酶的最適反應(yīng)溫度,此結(jié)果與吳會(huì)廣等[8]報(bào)道的錳過氧化物酶最適酶解溫度為55℃的結(jié)論基本相符。
金屬離子對(duì)酶的影響是多方面的,離子種類、離子電荷數(shù)、離子半徑大小以及離子濃度等,都會(huì)對(duì)酶的活性產(chǎn)生不確定的影響。吳會(huì)廣[8]研究表明,鐵離子的濃度越低其抑制作用越小,本試驗(yàn)結(jié)果Fe2+的強(qiáng)抑制作用與所用濃度有很大關(guān)聯(lián)。金屬離子對(duì)酶的作用有兩種:一是作用酶的輔助因子,二是作為激活劑起作用,但是金屬離子與酶如何相互作用改變生物活性的分子機(jī)理仍然有待于進(jìn)一步研究。
由試驗(yàn)結(jié)果可知,木質(zhì)層孔菌產(chǎn)錳過氧化物酶的最佳條件,即培養(yǎng)溫度35℃、碳源為小麥秸粉1.5 g/100 ml、氮源為胰蛋白胨0.5 g/100 ml、最佳培養(yǎng)時(shí)間為8 d。通過對(duì)產(chǎn)酶條件的優(yōu)化,最高酶活力可達(dá)1 180.3 U/l,這比優(yōu)化前的木質(zhì)層孔菌錳過氧化物酶產(chǎn)量提高了5.5倍。
酶作用特性研究結(jié)果顯示,木質(zhì)層孔菌產(chǎn)錳過氧化物酶的最適反應(yīng)溫度為52℃;最佳pH值范圍在4~5之間;在金屬離子的影響條件下,Zn2+和Ca2+對(duì)MnP的活力有促進(jìn)作用;Mg2+對(duì)MnP的活力影響不是很大;Cu2+、Fe2+和Ag+可使錳過氧化物酶的相對(duì)活性下降,具有對(duì)錳過氧化物酶活性的抑制作用,其中Fe2+的抑制作用最強(qiáng)。
[1] 趙紅霞,楊建軍,詹勇.白腐真菌在秸稈作物資源開發(fā)中的研究[J].飼料工業(yè),2002,23(11):40-42.
[2] 蘇小軍,熊興耀,譚興和,等.黑曲霉AF-1固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生淀粉酶的條件優(yōu)化[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,35(2):208-212.
[3] Pease E,Tien M.Heterogene and regulation of manganese peroxidases from phanerochaete ehrysos-Porium[J].Baeteriol.,1992,174:3532-3540.
[4] 董旭杰,曹福祥,陳靜,等.3種白腐菌木質(zhì)素降解酶的比較[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2006,27(3):131-135.
[5] 劉夢(mèng)茹,付時(shí)雨,詹懷宇,等.錳過氧化物酶應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2006,26(20):112-116.
[6] 楊曉寬,杜連祥,路福平.白腐菌產(chǎn)錳過氧化物酶培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].生物技術(shù),2004,14(3):49-50.
[7] 董旭杰,曹福祥,龍絳雪.木質(zhì)層孔菌產(chǎn)錳過氧化物酶條件的優(yōu)化[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2009,21(3):94-95.
[8] 吳會(huì)廣.Rhizoctoniasp-SYBC-M3產(chǎn)MnP發(fā)酵條件的優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究[D].江蘇無錫:江南大學(xué),2008.