王慧，蘆廣慶，楊寶鵬，王帆，喻其林，徐寧，程欣欣，邢來君，李明春

1 南開大學(xué)微生物學(xué)系 分子微生物學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071

2 農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，天津 300191

白念珠菌Candida albicans是醫(yī)院獲得性真菌病的主要感染源之一，也是深部真菌感染的首要病原菌，引起的致死率可達(dá)38%~49%[1-2]。臨床上，在白念珠菌感染的治療過程中，凸顯的嚴(yán)重問題就是菌株對(duì)各類藥物產(chǎn)生的抗藥性，尤其是對(duì)唑類藥物[3]。在光滑念珠菌Candida glabrata和釀酒酵母中，對(duì)唑類藥物的耐受性都是受到Ca2+信號(hào)調(diào)控的[4-5]，當(dāng)暴露于抗真菌藥物下時(shí)，細(xì)胞膜的穩(wěn)定性受到干擾，導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+濃度上升[6]。

鈣細(xì)胞存活 (Calcium cell survival，CCS)[7]途徑是 Bonilla等首次在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，通過 Cch1-Mid1鈣通道引發(fā)Ca2+內(nèi)流，并借助鈣信號(hào)的傳遞，激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 (Calcineurin，CaN) 及其下游轉(zhuǎn)錄因子Crz1p來介導(dǎo)細(xì)胞參與多種外界壓力下的存活。通常情況下，Cch1和Mid1組成蛋白復(fù)合體[8]，Cch1是核心，作為復(fù)合體的催化亞基，而Mid1作為調(diào)節(jié)亞基輔助Cch1完成鈣通道復(fù)合體的功能，二者缺一不可。在釀酒酵母中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力能夠通過 Mpk1途徑激活 Cch1-Mid1鈣離子通道，引起胞內(nèi) Ca2+濃度的上升，變化的 Ca2+與CaM結(jié)合，進(jìn)而激活CaN[9]。因此，Cch1和Mid1對(duì)CaN的激活具有調(diào)控作用，之后借助胞內(nèi)Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)體，降低胞內(nèi)的Ca2+水平，同時(shí)也調(diào)控著這些胞內(nèi)鈣泵的活性。

CCS途徑中的CaN參與抗真菌藥物的耐受性[10]，其催化亞基Cna1或調(diào)節(jié)亞基Cnb1任何一個(gè)的缺失都會(huì)對(duì)抗真菌藥物表現(xiàn)出強(qiáng)烈的敏感性，同時(shí)對(duì)白念珠菌菌株毒力也具有減弱的作用，有研究表明，對(duì)唑類藥物例如氟康唑FLUC呈現(xiàn)耐受性的菌株往往具有更強(qiáng)的致病性[11]，可見白念珠菌的藥物耐受性與致病性之間有密切的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，作用于 CaN的免疫抑制劑環(huán)孢菌素 (Cyclosporin A，CsA) 或他克莫司(FK506) 與氟康唑 (FLUC) 的聯(lián)合使用具有殺滅真菌的作用，而FLUC的單獨(dú)使用僅僅具有抑制真菌的作用[12]。CCS途徑對(duì)于真菌在唑類藥物壓力下的存活發(fā)揮著重要作用，缺少 CCS途徑的酵母在僅僅能抑制細(xì)胞生長的唑類藥物濃度下就死亡了[13]，CCS途徑中其他成員或是尚未鑒定出來的新成員也有可能參與到藥物耐受性中。是否 Cch1-Mid1也參與白念珠菌的藥物耐受性？我們將利用微量液基稀釋法和藥物平板敏感性試驗(yàn)進(jìn)行研究，并進(jìn)一步通過建立小鼠系統(tǒng)感染模型的方法研究CCH1或MID1基因的缺失對(duì)菌株毒力的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和引物

實(shí)驗(yàn)使用的菌株和質(zhì)粒見表1，引物見表2。

1.2 主要試劑

CIAP堿性磷酸酶、各種限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶等購自寶生物大連有限責(zé)任公司；RPMI1640培養(yǎng)基粉末購自GBCO公司；5-氟乳清酸 (5-FOA) 購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氟康唑 (FLUC)、伊曲康唑 (ITRA) 等唑類藥物購自Sigma公司；鹽酸維拉帕米 (Vpi)、鹽酸特比萘芬 (TER) 等藥物購自中國藥品生物制品檢定所；其余有機(jī)試劑和藥品均為國產(chǎn)分析純，所有引物均由北京奧科公司合成。

表1 本實(shí)驗(yàn)使用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本實(shí)驗(yàn)所用的引物Table 2 Primers used in this study

1.3 培養(yǎng)基

白念珠菌培養(yǎng)使用的所有培養(yǎng)基 (SC-ura除外) 均添加終濃度為80 mg/L的尿苷。YPD培養(yǎng)基：1%酵母浸出粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖。SC培養(yǎng)基：0.67%無氨基酵母氮源，0.2%氨基酸混合物粉末，2%葡萄糖。5-氟乳清酸 (5-FOA)培養(yǎng)基 (1 L)：6.7 g無氨基酵母碳源，20 g葡萄糖，0.8 g尿苷，2 g無氨基酸混合粉末，20 g瓊脂粉，1 g 5-氟乳清酸 (5-FOA)。RPMI 1640培養(yǎng)基：2.080 g RPMI 1640粉末，6.906 g苯磺酸 (MOPS)，40 mL 10%葡萄糖溶液，加蒸餾水定容到200 mL，混勻后用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至7.0，使用前進(jìn)行抽濾除菌。

1.4 白念珠菌CCH1和MID1基因回補(bǔ)質(zhì)粒的構(gòu)建

設(shè)計(jì)一對(duì)帶有PstⅠ酶切位點(diǎn)的引物CCH1-5RC和CCH1-3RC，以NKC18基因組DNA為模板，擴(kuò)增獲得一條8.7 kb的片段，其中包括1 kb的啟動(dòng)子、CCH1基因的ORF區(qū)和終止子區(qū)。將該片段用PstⅠ進(jìn)行酶切，純化后與同樣經(jīng)過PstⅠ內(nèi)切酶消化過，并經(jīng)堿性磷酸酶CIAP去磷酸化處理的白念珠菌表達(dá)質(zhì)粒pCR4進(jìn)行連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并在 LB+Amp的固體培養(yǎng)基中篩選轉(zhuǎn)化子，獲得正確的質(zhì)粒pCR4-CCH1。pCR4-MID1質(zhì)粒的獲得需要設(shè)計(jì)一對(duì)帶有 BamHⅠ和 KpnⅠ酶切位點(diǎn)的MID1-5RC和MID1-3RC引物，同樣以NKC18基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得一條3.1 kb包含MID1基因1 kb啟動(dòng)子、ORF區(qū)和終止子區(qū)的片段。將該片段用BamHⅠ和KpnⅠ進(jìn)行雙酶切，純化后與同樣經(jīng)過 BamHⅠ/KpnⅠ消化過的pCR4質(zhì)粒進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并獲得正確的質(zhì)粒pCR4-MID1。

1.5 藥物平板敏感性試驗(yàn)

挑取不同實(shí)驗(yàn)菌株的單菌落，接種至 5 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃過夜培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)接至30 mL YPD液體培養(yǎng)基中使起始OD600約為0.1，30 ℃培養(yǎng)大約4~5 h到對(duì)數(shù)生長期，加入藥物氟康唑或伊曲康唑至各預(yù)計(jì)的終濃度，在37 ℃進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。分別在預(yù)先設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)：0、5、10、20、30、60、90 min時(shí)取樣，每次取5 μL點(diǎn)在固體YPD平板上，點(diǎn)樣后，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并拍照。

1.6 微量液基稀釋法

依照酵母菌敏感性測(cè)定 CLSI-M27-A2方案[15]的微量液基稀釋法對(duì)野生型菌株和其他各缺失菌株進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定。

1.7 小鼠感染模型的建立

進(jìn)行毒力分析建模的小鼠為ICR雌性小鼠，鼠齡為6~8周。注射用的各菌株在SC培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)并轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基中再培養(yǎng)3~4 h，然后取適量菌液離心后懸浮于1 mL 0.9%生理鹽水中，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。分別用生理鹽水將各株注射用菌株的菌液濃度調(diào)至 5×106cells/mL。用0.25 mL注射器和4號(hào)針頭注射小鼠尾靜脈，每只小鼠注射0.1 mL菌液，每種菌株注射10只小鼠。隨后每天對(duì)小鼠的死亡情況進(jìn)行觀察和記錄，觀察周期為30 d。通過繪制小鼠的存活率曲線，利用SPSS軟件進(jìn)行Kaplan-Meier Test統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，來判定不同菌株的毒力變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 白念珠菌CCH1和MID1基因回補(bǔ)缺失菌株的構(gòu)建

質(zhì)粒pCR4含有的選擇標(biāo)記為URA3，缺失菌株cch1Δ/Δ (cch1::CCH1/cch1:: URA3-dpl200)和 mid1Δ/Δ (mid1::MID1/mid1:: URA3-dpl200)中的URA3標(biāo)記必須被消除后，才能使用構(gòu)建的pCR4-CCH1和pCR4-MID1質(zhì)粒用于相應(yīng)基因的回補(bǔ)。分別將cch1Δ/Δ和mid1Δ/Δ缺失菌株涂布于含有5-FOA和尿苷的SC培養(yǎng)基中，用于標(biāo)記的彈出。3 d后挑取轉(zhuǎn)化子，提取基因組并以CCH1/MID1-5det和CCH1/MID1-3det為引物，檢測(cè)基因型。對(duì)于沒有去除URA3標(biāo)記的菌株，PCR得到兩條帶，分別為ARG4和URA3標(biāo)記帶[14]；而對(duì)于去除URA3標(biāo)記的菌株，ARG4標(biāo)記帶保留，由于缺失菌株中的URA3-dpl200片段兩端含有同源序列，在 5-FOA選擇壓力下能夠?qū)⒆陨憝h(huán)化，從基因組中彈出一部分，使檢測(cè)帶變短。如圖 1所示，對(duì)于 URA3標(biāo)記消除的cch1Δ/Δ菌株，PCR檢測(cè)正確的結(jié)果為 2.3 kb (ARG4) 和1.0 kb (泳道1,2)；對(duì)于mid1Δ/Δ菌株，PCR檢測(cè)正確的結(jié)果為2.4 kb (ARG4) 和750 bp (泳道3,4)，表明我們獲得了正確的URA3標(biāo)記被消除的菌株 cch1::ARG4/cch1::dpl200 和mid1::ARG4/mid1:: dpl200，分別命名為 NKC61和NKC60。

圖1 URA3標(biāo)記消除的cch1Δ/Δ和mid1Δ/Δ菌株的鑒定Fig. 1 PCR analysis of URA3 dropping out in cch1Δ/Δ and mid1Δ/Δ strains. 1?4: genomic DNA from cch1Δ/Δ and mid1Δ/Δ strains were used as templates for PCR detection; 5: NKC18 was used as template with primers MID1-5detect and MID1-3detect (1.7 kb); M: DNA marker Ⅲ.

將pCR4和pCR4-CCH1分別轉(zhuǎn)化NKC61菌株，再將pCR4和pCR4-MID1分別轉(zhuǎn)化NKC60菌株，在SC-Ura選擇性培養(yǎng)基中篩選轉(zhuǎn)化子，分別以CCH1/MID-RC1 和CCH1/MID1-RC2為檢測(cè)引物進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的 PCR驗(yàn)證，該引物從CCH1和MID1基因所敲除的那部分序列中設(shè)計(jì)選取，鑒定結(jié)果如圖2所示：對(duì)于cch1Δ/Δ+CCH1回補(bǔ)菌株，擴(kuò)增得到 1.0 kb的片段；對(duì)于mid1Δ/Δ+MID1回補(bǔ)菌株，擴(kuò)增得到824 bp的片段；而轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒的 cch1Δ/Δ+pCR4 和mid1Δ/Δ+pCR4菌株，PCR擴(kuò)增沒有能夠得到目的條帶，依此鑒定并獲得了正確的回補(bǔ)缺失菌株cch1Δ/Δ+CCH1和 mid1Δ/Δ+MID1，并將該菌株分別命名為NKC53和NKC55。

圖2 回補(bǔ)缺失菌株 cch1Δ/Δ+CCH1和 mid1Δ/Δ+ MID1的鑒定Fig. 2 PCR analysis of cch1Δ/Δ and mid1Δ/Δ recomplementation. M: markerⅢ. (A) 1: cch1Δ/Δ+ CCH1 (1.0 kb); 2: cch1Δ/Δ+pCR4. (B) 1: mid1Δ/Δ+ pCR4; 2: mid1Δ/Δ+MID1 (824 bp). Genomic DNA from all strains was used as templates with primers CCH1/MID-RC1 and CCH1/MID1-RC2.

2.2 CCH1或MID1基因的缺失對(duì)藥物敏感性的變化

為了更方便地對(duì)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較分析，使用從臨床分離的耐藥型和敏感型的白念珠菌，作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。以ATCC22019作為質(zhì)控菌株，如表3所示，質(zhì)控菌株對(duì)FLUC的MIC值為2或4 mg/L，對(duì)ITRA的MIC值為0.064或0.128 mg/L，均在CLSI M27-A2規(guī)定的范圍內(nèi)[16]，證明操作無誤，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。用微量液基稀釋法測(cè)定菌株對(duì)藥物的敏感性時(shí)，通常用以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行界限判定：以 FLUC對(duì)菌株的MIC≤8 mg/L為敏感，16~32 mg/L為劑量依賴性敏感，MIC≥64 mg/L為耐藥；以ITRA對(duì)菌株的MIC≤0.12 mg/L為敏感，0.25~0.5 mg/L為劑量依賴性敏感，≥1 mg/L為耐藥。表3的結(jié)果顯示：1) 對(duì)照組CA03997和CA90菌株的MIC測(cè)定結(jié)果均符合以上判定標(biāo)準(zhǔn)，分別為藥物耐受菌和敏感菌，保證了實(shí)驗(yàn)體系沒有問題；2) 野生型菌株對(duì)FLUC和ITRA藥物的敏感性可以界定為劑量依賴性敏感；3) cch1Δ/Δ 和mid1Δ/Δ缺失菌株對(duì)FLUC和ITRA均表現(xiàn)出藥物敏感性，并接近于敏感菌CA90的MIC值；4) 回補(bǔ)缺失菌株cch1Δ/Δ+CCH1和mid1Δ/Δ+MID1對(duì)藥物的敏感性也在接近劑量依賴性敏感的范圍，接近于野生型菌株的水平，表明Cch1-Mid1參與了白念珠菌對(duì)唑類藥物耐受性的調(diào)控。

我們同時(shí)也利用固體平板藥物敏感性試驗(yàn)，觀察并分析了上述不同菌株對(duì)藥物 FLUC敏感性的變化。將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至添加有8 mg/L FLUC的YPD培養(yǎng)基中，在37 ℃振蕩培養(yǎng)，并且按圖3所示的不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣，分別取樣5 μL，點(diǎn)種在YPD固體平板上。37 ℃靜置培養(yǎng)16 h后，觀察結(jié)果如圖3所示：cch1Δ/Δ和mid1Δ/Δ缺失菌株對(duì)FLUC表現(xiàn)出高度的敏感性，菌體生長狀況與敏感菌相似；CCH1和MID1基因的回補(bǔ)對(duì)這種敏感表型具有恢復(fù)作用，但不能恢復(fù)至與野生型菌株相似的敏感表型；以上結(jié)果再次表明CCH1和MID1基因的缺失與FLUC藥物敏感性有關(guān)。

表3 各菌株對(duì)唑類藥物的敏感性Table 3 Susceptibility of C. albicans strains to azoles

2.3 CCH1和MID1基因參與藥物耐受的機(jī)制推測(cè)

圖3 FLUC藥物平板敏感性試驗(yàn)Fig. 3 Susceptibility assay to FLUC.

圖4 Ca2+對(duì)藥物抗真菌活性的調(diào)節(jié)作用Fig. 4 Calcium modulation of antifungal drug activity.

Cch1-Mid1鈣通道調(diào)控 Ca2+的內(nèi)流，而CCH1和 MID1基因的缺失對(duì)藥物表現(xiàn)出敏感性，Ca2+的濃度調(diào)節(jié)很可能與藥物耐受性有關(guān)，所以我們?cè)谒幬颋LUC、ITRA和TER作用的基礎(chǔ)上，分別添加0.05 mol/L或0.25 mol/L的Ca2+、0.5 mmol/L鈣螯合劑EGTA或32 mg/L鈣通道阻滯劑維拉帕米Vpi，利用劃線培養(yǎng)的方法，對(duì)以上不同菌株的生長情況進(jìn)行了比較，來研究CCH1和MID1基因參與藥物耐受的機(jī)制。培養(yǎng)基放置于30 ℃培養(yǎng)，3 d后觀察結(jié)果，如圖4所示：1) 在對(duì)照組所在列，除野生型菌株和耐藥菌CA03997外，其他各缺失菌株和敏感菌CA90對(duì)唑類藥都表現(xiàn)出不同程度的敏感性；2) 低濃度0.05 mol/L Ca2+的添加抑制了唑類藥物對(duì)白念珠菌的抗真菌活性，與對(duì)照組相比，所有菌株的生長狀況有所好轉(zhuǎn)，表明少量 Ca2+的存在幫助細(xì)胞獲得了一定程度的對(duì)唑類藥物的耐受性；3) 高濃度0.25 mol/L Ca2+、EGTA或Vpi的添加，與對(duì)照組相比，都增強(qiáng)了唑類藥物對(duì)各菌株的抑制作用，使菌株的生長狀況變得更差了；4) 然而，低濃度和高濃度Ca2+的添加都抑制了丙烯酰胺類藥物TER的作用活性，但EGTA或Vpi的添加卻同樣也對(duì) TER活性有增強(qiáng)作用，菌株表現(xiàn)出對(duì)藥物更加敏感。綜合以上結(jié)果表明：不同的 Ca2+濃度能夠通過改善或抑制藥物的抗真菌活性，來間接調(diào)節(jié)白念珠菌對(duì)藥物的耐受性，雖然對(duì)唑類藥物和丙烯酰胺類藥物耐受的調(diào)控方式不同，但可以確定的是CCH1和MID1基因參與藥物耐受性的調(diào)控，也是通過對(duì)Ca2+濃度變化的間接調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)的。

2.4 CCH1或MID1基因的缺失對(duì)白念珠菌毒力的影響

白念珠菌的藥物耐受性和致病性之間有密切關(guān)系，所以我們通過建立小鼠系統(tǒng)感染模型的方法來進(jìn)一步分析CCH1和MID1基因在影響菌株毒力方面的作用。在實(shí)驗(yàn)中，共飼養(yǎng) 50只小鼠，將這些小鼠隨機(jī)平均分成1~5組，各組小鼠通過尾靜脈分別注射野生型菌株、cch1Δ/Δ+ CCH1和mid1Δ/Δ+MID1回補(bǔ)菌株以及cch1Δ/Δ和mid1Δ/Δ缺失菌株，每種菌株注射10只小鼠，然后每天觀察并記錄小鼠的存活情況，觀察周期為30 d。利用Kaplan-Meier Test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，判定不同組小鼠之間的生存差異，結(jié)果表明：注射野生型菌株、cch1Δ/Δ+CCH1和 mid1Δ/Δ+ MID1小鼠的平均存活時(shí)間分別為 12.2、14.6、15 d，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，在野生型菌株和回補(bǔ)菌株之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P=0.306或0.233)，然而注射cch1Δ/Δ和mid1Δ/Δ缺失菌株小鼠的平均存活時(shí)間為22.9 d和21.3 d，與野生型菌株之間存在差異，并且差異在極顯著水平 (P＜0.01) (圖5)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CCH1和MID1基因的缺失導(dǎo)致菌株的毒力大大降低。

圖5 感染不同菌株的小鼠存活中位數(shù)分析Fig .5 Virulence assay of C. albicans strains.

3 討論

CCS途徑在介導(dǎo)酵母細(xì)胞存活的過程中發(fā)揮著非常廣泛的作用，在這個(gè)途徑中，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的功能在許多真核細(xì)胞中已被證實(shí)，并且有證據(jù)表明Cch1-Mid1鈣通道能夠通過調(diào)控Ca2+的內(nèi)流，對(duì)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶產(chǎn)生激活作用[7,13]。最初的 Ca2+波動(dòng)引起一系列相關(guān)應(yīng)答來幫助細(xì)胞在壓力環(huán)境下存活，說明Cch1p和Mid1p在保證細(xì)胞存活方面發(fā)揮著最為基礎(chǔ)的作用，因此，在我們的工作中，重點(diǎn)對(duì)白念珠菌 CCS途徑中CCH1和MID1基因缺失所引起的藥物耐受性和菌株毒力的變化進(jìn)行研究。

CCH1和 MID1基因參與藥物耐受性的調(diào)控，可以理解為通過調(diào)節(jié)Ca2+的作用，參與介導(dǎo)細(xì)胞在藥物壓力下的存活。這在我們的實(shí)驗(yàn)中也得到證實(shí)，CCH1和MID1基因的缺失在藥物作用下表現(xiàn)的更為敏感，使用Ca2+的螯合劑EGTA或鈣通道阻滯劑 Vpi聯(lián)合抗真菌藥物一起作用時(shí)，能夠改善藥物作用。所以，以此確定 CCS途徑通過對(duì) Ca2+的調(diào)節(jié)，間接參與了藥物耐受性。小鼠感染模型實(shí)驗(yàn)證明cch1Δ/Δ和mid1Δ/Δ菌株的毒力明顯比野生型菌株弱，這與許多基因缺失突變對(duì)菌株毒力的影響非常相似。白念珠菌毒力的形成也是多種因素累積的效果，比如蛋白酶的分泌[11]，細(xì)胞表面黏附素的合成[17]等。當(dāng)細(xì)胞在接受外界持續(xù)和難以預(yù)知的生物或物理因子干擾的時(shí)侯，包括溫度、環(huán)境pH、離子毒力、氧化脅迫壓力和藥物作用等，白念珠菌在借助適當(dāng)?shù)耐緩絹砀兄蛻?yīng)答這些環(huán)境信號(hào)的同時(shí)，就會(huì)引起細(xì)胞自身的生理學(xué)、形態(tài)以及粘附特性的改變，從而提高細(xì)胞對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)性，因此表現(xiàn)為菌株毒力發(fā)生變化。在我們的實(shí)驗(yàn)中同時(shí)也發(fā)現(xiàn)cch1Δ/Δ和mid1Δ/Δ菌株并不是完全毒力喪失，只是毒力減弱了，但仍然能夠?qū)π∈螽a(chǎn)生致死性的感染。這表明小鼠體內(nèi)的這種環(huán)境可能誘導(dǎo)了其他一種或幾種途徑促進(jìn)了 cch1Δ/Δ和mid1Δ/Δ菌株的菌絲形成，或者與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的作用有關(guān)?？傊珻CH1和MID1基因在參與白念珠菌藥物耐受性和致病性調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用。白念珠菌的致病性與藥物耐受性之間有密切的關(guān)系。分泌型天冬氨酸蛋白酶 (Sap) 目前被認(rèn)為是白念珠菌主要的毒力因子之一[18]，與白念珠菌的黏附力和組織侵襲有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)對(duì)藥物呈現(xiàn)耐受性的菌株比藥物敏感株具有更大的毒性，而且耐藥株在FLUC濃度逐漸增加的環(huán)境下生長會(huì)導(dǎo)致劑量依賴性的體外分泌型天冬氨酸蛋白酶產(chǎn)量增加[19]，以及耐藥基因 MDR1的過度表達(dá)。Fekete-Forgacs等將FLUC敏感型的野生型白念珠菌誘導(dǎo)為耐FLUC的實(shí)驗(yàn)變異株，發(fā)現(xiàn)變異株的Sap分泌明顯強(qiáng)于自然分離菌株[20]，在臨床白念珠菌耐藥和致病性的研究中，更多的是用蛋白酶活力作為反映耐藥菌株毒力和致病性強(qiáng)弱的直接指標(biāo)[21]。所以，在我們的實(shí)驗(yàn)中，是否在那些對(duì)藥物呈現(xiàn)敏感性的 cch1Δ/Δ和

mid1Δ/Δ菌株中，分泌型天冬氨酸蛋白酶的產(chǎn)量也會(huì)表現(xiàn)為降低，還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

致謝：本實(shí)驗(yàn)中的部分菌株和質(zhì)粒由明尼蘇達(dá)大學(xué)Dr. Dana Davis教授和江南大學(xué)蔣伶活教授惠贈(zèng)，在此表示衷心感謝!

[1] Koh AY, K?hler JR, Coggshall KT, et al. Mucosal damage and neutropenia are required for Candida albicans dissemination. PLoS Pathog, 2008, 4(2): e35.

[2] Ruhnke M, Maschmeyer G. Management of mycoses in patients with hematologic disease and cancer——review of the literature. Eur J Med Res, 2002, 7(5): 227?235.

[3] Andes D, Forrest A, Lepak A, et al. Impact of antimicrobial dosing regimen on evolution of drug resistance in vivo: fluconazole and Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother, 2006, 50(7): 2374?2383.

[4] Edlind T, Smith L, Henry K, et al. Antifungal activity in Saccharomyces cerevisiae is modulated by calcium signalling. Mol Microbiol, 2002, 46(1): 257?268.

[5] Kaur R, Casta?o I, Cormack BP. Functional genomic analysis of fluconazole susceptibility in the pathogenic yeast Candida glabrata: roles of calcium signaling and mitochondria. Antimicrob Agents Chemother, 2004, 48(5): 1600?1613.

[6] Patterson RL, van Rossum DB, Gill DL. Storeoperated Ca2+entry: evidence for a secretion-like coupling model. Cell, 1999, 98(4): 487?499.

[7] Bonilla M, Cunningham KW. Mitogen-activated protein kinase stimulation of Ca2+signaling is required for survival of endoplasmic reticulum stress in yeast. Mol Biol Cell, 2003, 14(10): 4296?4305.

[8] Peiter E, Fischer M, Sidaway K, et al. The Saccharomyces cerevisiae Ca2+channel Cch1pMid1p is essential for tolerance to cold stress and iron toxicity. FEBS Lett, 2005, 579(25): 5697?5703.

[9] Aramburu J, Heitman J, Crabtree GR. Calcineurin: a central controller of signalling in eukaryotes. EMBO Rep, 2004, 5(4): 343?348.

[10] Sanglard D, Ischer F, Marchetti O, et al. Calcineurin A of Candida albicans: involvement in antifungal tolerance, cell morphogenesis and virulence. Mol Microbiol, 2003, 48(4): 959?976. [11] Wu T, Wright K, Hurst SF, et al. Enhanced extracellular production of aspartyl proteinase, a virulence factor, by Candida albicans isolates following growth in subinhibitory concentrations of fluconazole. Antimicrob Agents Chemother, 2000, 44(5): 1200?1208.

[12] Li Y, Sun SJ, Guo QJ, et al. In vitro interaction between azoles and cyclosporin A against clinical isolates of Candida albicans determined by the chequerboard method and time-kill curves. J Antimicrob Chemother, 2008, 61(3): 577?585.

[13] Bonilla M, Nastase KK, Cunningham KW. Essential role of calcineurin in response to endoplasmic reticulum stress. EMBO J, 2002, 21(10): 2343?2353.

[14] Wang H, Xu N, Xing LJ, et al. Effect of CCH1 and MID1 in calcium influx under alkaline pH and its regulation by Crz1p transcription factor in Candida albicans. Chin J Biotech, 2011, 27(6): 917?925.王慧, 徐寧, 邢來君, 等. 堿性pH條件下白念珠菌鈣離子通道CCH1和MID1基因?qū)︹}內(nèi)流的影響及Crz1p轉(zhuǎn)錄因子對(duì)其的調(diào)控作用. 生物工程學(xué)報(bào), 2011, 27(6): 917?925.

[15] CLSI/NCCLS, Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Approved standard M27-A2. National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2002.

[16] Pfaller MA, Messer SA, Bolmstr?m A, et al. Multisite reproducibility of the Etest MIC method for antifungal susceptibility testing of yeast isolates. J Clin Microbiol, 1996, 34(7): 1691?1693.

[17] Krasowska A, Murzyn A, Dyjankiewicz A, et al. The antagonistic effect of Saccharomyces boulardii on Candida albicans filamentation, adhesion and biofilm formation. FEMS Yeast Res, 2009, 9(8): 1312?1321.

[18] Schaller M, Januschke E, Schackert C, et al. Different isoforms of secreted aspartyl proteinases (Sap) are expressed by Candida albicans during oral and cutaneous candidosis in vivo. J Med Microbiol, 2001, 50(8): 743?747.

[19] Costa CR, Jesuíno RSA, de Aquino Lemos J, et al. Effects of antifungal agents in sap activity of Candida albicans isolates. Mycopathologia, 2010, 169(2): 91?98.

[20] Fekete-Forgács K, Gyüre L, Lenkey B. Changes of virulence factors accompanying the phenomenon of induced fluconazole resistance in Candida albicans. Mycoses, 2000, 43(7/8): 273?279.

[21] Jayatilake JAMS, Samaranayake YH, Cheung LK, et al. Quantitative evaluation of tissue invasion by wild type, hyphal and SAP mutants of Candida albicans, and non-albicans Candida species in reconstituted human oral epithelium. J Oral Pathol Med, 2006, 35(8): 484?491.