鐘正偉，王莉潔，謝輝，李輝,3，何劍為,3，宋有濤,3

1 遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧 沈陽 110036

2 承德石油高等專科學(xué)?；瘜W(xué)工程系，河北 承德 067000

3 遼寧省動(dòng)物資源與疫病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110036

朊病毒是一類能在哺乳動(dòng)物中引起瘋牛病、綿羊瘙癢癥和人克雅氏病等可傳染性海綿樣腦病的病原體，迄今為止對(duì)于朊病毒疾病仍缺乏有效的治療藥物[1-2]。近年來，利用抗朊病毒藥物篩選模型篩選抗朊病毒候選藥物是國(guó)際上的研究熱點(diǎn)，研究者通過構(gòu)建動(dòng)物模型、動(dòng)物細(xì)胞模型、無細(xì)胞模型和酵母模型在抗朊病毒候選藥物的篩選方面進(jìn)行了大量研究，獲得了戊聚糖多硫酸酯、剛果紅、四磺酸基酞菁、兩性霉素B和奎納克林等一系列具有抗朊病毒作用效果的候選藥物[3-9]。

由于酵母朊病毒[PSI+]具有易于檢測(cè)的遺傳表型 (紅色為正常型，白色為致病型) 及其與動(dòng)物具有嚴(yán)格種間屏障的優(yōu)勢(shì)，因此基于酵母細(xì)胞的抗朊病毒候選藥物篩選模型在大規(guī)模篩選上具有經(jīng)濟(jì)、安全和易實(shí)現(xiàn)高通量篩選等特性而越來越受到關(guān)注[5-10]。利用酵母朊病毒的遺傳表型并結(jié)合蛋白水平的 SDS-PAGE/Western blotting分析，Bach等從近4 000種小分子化合物中篩選發(fā)現(xiàn)了菲啶 (Phenanthridine，Phen)、6-氨基菲啶(6-Aminophenanthridine) 等 11種化合物可以使酵母朊病毒的致病型白色表型轉(zhuǎn)換為正常型紅色表型，同時(shí)其淀粉樣聚集狀態(tài)可以轉(zhuǎn)換為可溶單體狀態(tài)[5]。值得注意的是，菲啶衍生物6-氨基菲啶作用酵母朊病毒[PSI+]后產(chǎn)生了93%的介于紅色的陽性表型與白色的陰性表型之間的粉色中間表型，該表型的朊病毒仍為聚集狀態(tài)，并在傳代實(shí)驗(yàn)中遺傳不穩(wěn)定，多次傳代后轉(zhuǎn)變?yōu)榘咨硇蚚5]。而在此前的研究中，鹽酸胍等化合物雖然能夠治愈[PSI+]卻不能引起酵母細(xì)胞粉色表型的出現(xiàn)[11]。

近年來的研究表明，朊病毒聚集體的大小較聚集狀態(tài)更能夠反映朊病毒“種子”(Seeds) 的聚集和傳播能力[12-14]。這暗示著在蛋白和細(xì)胞水平對(duì)朊病毒聚集體大小的定量分析可以更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)抗朊病毒候選藥物的作用效果，尤其是對(duì)粉色中間表型而言。因此，本研究利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的新型抗朊病毒藥物篩選酵母模型，即基因重組的熒光標(biāo)簽 GFP插入 Sup35 (NGMC) 的[GPSI+]酵母菌株，引入熒光漂白后恢復(fù)技術(shù)(Fluorescence redistribution after photobleaching，F(xiàn)RAP) 和半變性瓊脂糖凝膠電泳 (Semidenaturing detergent-agarose gel electrophoresis，SDD-AGE) 技術(shù)分別在細(xì)胞水平和蛋白水平定量分析了菲啶作用后酵母細(xì)胞內(nèi)朊病毒聚集體的大小變化[15-17]。另外，本研究還系統(tǒng)研究了菲啶作用后產(chǎn)生的粉色表型酵母中朊病毒的聚集狀態(tài)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果彌補(bǔ)了Bach等對(duì)菲啶等化合物的抗酵母朊病毒效果缺乏細(xì)胞和蛋白水平定量分析的缺陷。更重要的是，該研究成果為基于酵母模型的抗朊病毒藥物次級(jí)篩選也提供了一套精確的定量方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

野生型酵母 779-6A (NMC)：MATα kar1 SUQ5 ade2-1 his3Δ202 leu2Δ1 trp1Δ63 ura3-52 sup35:: KanMX/ pJ501，[PSI+]，由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院 (NIH) Masison DC. 博士惠贈(zèng)。重組型酵母(NGMC)：MATα kar1 SUQ5 ade2-1 his3Δ202 leu2Δ1 trp1Δ63 ura3-52 sup35 :: KanMX/pJ510，[GPSI+]，GFP基因插入SUP35基因的第123~124位之間，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。將[PSI+]或[GPSI+]細(xì)胞劃線至含有5 mmol/L鹽酸胍的1/2YPD固體平板上，培養(yǎng)7 d后，分離紅色單菌落得到[psi-]或[Gpsi-]細(xì)胞。

1.1.2 培養(yǎng)基

1/2YPD培養(yǎng)基：酵母浸粉0.5%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，固體平板加入2%瓊脂。

YPAD培養(yǎng)基：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，腺嘌呤0.04%，固體平板加入2%瓊脂。

YPD培養(yǎng)基：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，固體平板加入2%瓊脂。

1.1.3 主要試劑和儀器

鹽酸胍、菲啶、刀豆球蛋白購(gòu)于Sigma公司，兔抗GFP抗體與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)于金斯特生物科技有限公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。瓊脂糖水平電泳槽 (DYCO-31DN，北京六一公司)、轉(zhuǎn)膜儀 (Bio-Rad公司，美國(guó))、珠磨破碎儀 (Biospec公司，美國(guó))、激光共聚焦顯微鏡(OLYMPUS FV1000S-SIM/IX81，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心)。

1.2 方法

1.2.1 遺傳表型實(shí)驗(yàn)

[PSI+]和[GPSI+]酵母細(xì)胞在 30 ℃過夜活化培養(yǎng)后，調(diào)整菌液OD600至0.2左右，按10%接種量分別接種到含有指定化合物的1/2YPD液體培養(yǎng)體系，所有體系于24 ℃振蕩培養(yǎng)5 d，在培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)間隔24 h更換培養(yǎng)基和化合物[5]。每天取培養(yǎng)液稀釋后涂布于1/2YPD固體平板，平板于24 ℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落顏色變化，統(tǒng)計(jì)不同顏色菌落的比例。

1.2.2 熒光焦點(diǎn) (Foci) 和FRAP實(shí)驗(yàn)

將化合物作用[GPSI+]酵母細(xì)胞1~5 d后涂布培養(yǎng)的1/2YPD固體平板上出現(xiàn)的不同顏色菌落接種到Y(jié)PAD液體培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)2 d后，取少量菌液滴在干燥的覆蓋有2 g/L刀豆球蛋白溶液的潔凈載玻片上，加蓋玻片并封片，在100倍共聚焦熒光顯微鏡 (OLYMPUS-FV1000型)下觀察朊病毒在酵母活細(xì)胞內(nèi)形成熒光焦點(diǎn)的情況。隨后利用熒光漂白后恢復(fù)技術(shù)在活細(xì)胞中分析酵母朊病毒聚集體的遷移速率。FRAP技術(shù)的原理是采用強(qiáng)激光在短時(shí)間內(nèi)將熒光分子漂白區(qū)域的熒光淬滅，由于活細(xì)胞內(nèi)分子處于流動(dòng)狀態(tài)，因此隨著漂白區(qū)域外的熒光分子逐漸流入，漂白區(qū)內(nèi)的熒光會(huì)逐漸恢復(fù)。通過測(cè)定漂白區(qū)域熒光恢復(fù)的速率可以獲得熒光分子遷移速率的相關(guān)信息[16,18]。FRAP實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)的方法并作適當(dāng)修正[16]，激發(fā)波長(zhǎng)為 488 nm，輸出功率為最大輸出功率的2%，針孔調(diào)整為3 μm，物鏡為40 倍，掃描整個(gè)樣品，選取漂白區(qū) (ROI)，漂白功率為100%，漂白程度為50%~80%，漂白后采集數(shù)據(jù)時(shí)間間隔設(shè)定為0.5 s，采集次數(shù)為40~50 次，漂白結(jié)束后，保存數(shù)據(jù)。按照公式FR(t)=(Ft?Fmin)/(Fi?Fmin) 計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度，其中Ft表示細(xì)胞漂白區(qū)在t時(shí)間的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)i表示t=0時(shí)間的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)min表示細(xì)胞漂白后的最小熒光強(qiáng)度，F(xiàn)R(t)表示t時(shí)間細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度。以FR(t)VS t作圖得到熒光漂白后恢復(fù)曲線。

1.2.3 SDD-AGE/Western blotting實(shí)驗(yàn)

將化合物作用[GPSI+]酵母細(xì)胞1~5 d后涂布培養(yǎng)的1/2YPD固體平板上出現(xiàn)的不同顏色菌落活化后接種到 YPD液體培養(yǎng)基中 30 ℃培養(yǎng)約12 h，到菌液 OD600=1.5左右時(shí)停止培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，然后加入裂解緩沖液，用珠磨儀裂解細(xì)胞，離心收集上清得到蛋白樣品；SDD-AGE/ Western blotting實(shí)驗(yàn)流程參考文獻(xiàn)的方法并作適當(dāng)調(diào)整[17]，進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后在0 ℃、100 V條件下轉(zhuǎn)膜1 h，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，兔抗-GFP抗原 (1∶2 000) 孵育1 h，4 ℃過夜，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG (1∶5 000)孵育1 h，采用ECL發(fā)光試劑盒對(duì)其進(jìn)行放射自顯影檢測(cè)，獲得圖像信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 菲啶對(duì)酵母朊病毒[PSI+]表型的影響

酵母朊病毒[PSI+]是翻譯終止因子 Sup35p的淀粉樣聚集形式[19]。在[PSI+]細(xì)胞中，Sup35p主要以聚集體形式存在導(dǎo)致無義突變抑制產(chǎn)生終止密碼子通讀現(xiàn)象，使ade2-1突變的[PSI+]細(xì)胞在腺嘌呤缺乏的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)為白色菌落；在被治愈的[psi-]細(xì)胞中，其Sup35p主要以可溶形式存在，非無義抑制的ade2-1突變株需要在含有腺嘌呤的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，細(xì)胞由于累積腺嘌呤合成途徑中的紅色中間產(chǎn)物而形成紅色菌落，這個(gè)顏色指示系統(tǒng)可用來初步分析酵母朊病毒的存在狀態(tài)[13]。鑒于在Bach的研究中，菲啶治愈野生型酵母朊病毒必須存在增效劑亞治愈濃度的鹽酸胍 (0.5 mmol/L，在此濃度下鹽酸胍可以通過部分競(jìng)爭(zhēng)性抑制 Hsp104的活性削弱[PSI+]的強(qiáng)度而不改變[PSI+]的性質(zhì))[5]，為此我們?cè)?.5 mmol/L鹽酸胍條件下研究菲啶對(duì)酵母朊病毒的治愈作用。如表1所示，陰性對(duì)照0.5 mmol/L鹽酸胍和陽性對(duì)照5 mmol/L鹽酸胍對(duì)酵母朊病毒[GPSI+]的5 d治愈率分別為0%和94.8%，而0.2 mmol/L菲啶在增效劑存在情況下治愈率為84.6%，與相同條件下菲啶和鹽酸胍對(duì)野生型[PSI+]的治愈率基本相似并略高。這暗示著在基于酵母的抗朊病毒藥物篩選過程中，可以用酵母朊病毒NGMC菌株代替野生型酵母朊病毒NMC菌株。

表1 酵母朊病毒[GPSI+]與[PSI+]對(duì)抗朊病毒化合物的敏感性比較Table 1 Comparison of the sensitivities to anti-prion compounds between yeast prions [GPSI+] and [PSI+]

為了深入研究菲啶對(duì)酵母朊病毒的治愈作用，我們統(tǒng)計(jì)了0.2 mmol/L菲啶作用于酵母菌株NGMC不同時(shí)間后的表型分布。如圖1所示，陽性對(duì)照5 mmol/L鹽酸胍作用于白色的[GPSI+]細(xì)胞2 d后紅色菌落逐漸增多，作用5 d后幾乎全為紅色菌落；0.2 mmol/L菲啶作用于[GPSI+]細(xì)胞3 d天后出現(xiàn)紅色菌落，作用5 d后紅色菌落的比例為84.6%，而且在菲啶作用[GPSI+]細(xì)胞1~5 d內(nèi)均出現(xiàn)了一定數(shù)量的粉色菌落，這與Bach的研究發(fā)現(xiàn)基本一致[5]。從表型上看，菲啶作用后的紅色菌落初步被認(rèn)為是治愈的[Gpsi-]，白色菌落為未治愈的[GPSI+]，粉色菌落可能是一種中間表型，但其細(xì)胞內(nèi)的朊病毒是否聚集或聚集體的大小需要進(jìn)一步的定量分析。

2.2 細(xì)胞水平菲啶對(duì)酵母朊病毒[GPSI+]治愈作用的定量分析

圖1 酵母朊病毒[GPSI+]在菲啶作用不同時(shí)間后的表型變化Fig. 1 Phenotype changes of [GPSI+] cells after treated by phenanthridine synergized with 0.5 mmol/L GuHCl for 1?5 days. W, P, R represent white, pink and red colonies, respectively.

插入GFP熒光標(biāo)簽的[GPSI+]酵母細(xì)胞的朊病毒 (NGMC) 由于聚集而呈現(xiàn)明亮的熒光焦點(diǎn)(Foci)，而[Gpsi-]細(xì)胞朊病毒是可溶的，因而其熒光呈發(fā)散狀態(tài)。如圖2A所示，0.2 mmol/L菲啶與0.5 mmol/L鹽酸胍協(xié)同作用酵母朊病毒1 d、3 d、5 d后的白色菌落呈現(xiàn)明亮的熒光焦點(diǎn)，說明其朊病毒為聚集狀態(tài)，而3 d、5 d后的紅色菌落其熒光呈發(fā)散狀態(tài)，說明其朊病毒為可溶狀態(tài)。另外，對(duì)照5 mmol/L鹽酸胍作用酵母朊病毒[GPSI+]后白色和紅色菌落的Foci實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果與菲啶基本一致。為了進(jìn)一步定量化紅色和白色菌落酵母細(xì)胞中朊病毒的聚集狀態(tài)，我們采用了更為精確的熒光漂白后恢復(fù)技術(shù) (FRAP) 檢測(cè)菲啶作用后[GPSI+]細(xì)胞中朊病毒NGMC的聚集體大小。如圖2B所示，[Gpsi-]細(xì)胞的NGMC被漂白后，相對(duì)熒光強(qiáng)度迅速上升，大約6 s后趨于平穩(wěn)，說明[Gpsi-]細(xì)胞的 NGMC流動(dòng)速率快，分子量?。欢鳾GPSI+]細(xì)胞的NGMC被漂白后，相對(duì)熒光強(qiáng)度升高緩慢，而且在20 s內(nèi)一直呈上升趨勢(shì)，說明其NGMC流動(dòng)速率慢，分子量大。菲啶作用[GPSI+]細(xì)胞1 d、3 d后的白色菌落的熒光蛋白光漂白恢復(fù)曲線趨勢(shì)與對(duì)照的[GPSI+]細(xì)胞類似，而且在20 s內(nèi)達(dá)到的最大相對(duì)熒光強(qiáng)度值無顯著差異，表明菲啶作用[GPSI+]細(xì)胞 1 d、3 d后形成的白色菌落內(nèi)與對(duì)照的[GPSI+]細(xì)胞相比較具有大小相當(dāng)?shù)腘GMC聚集體，這說明菲啶作用1 d、3 d后的白色菌落是沒有被治愈的[GPSI+]。另一方面，菲啶作用[GPSI+]細(xì)胞后3 d、5 d后的紅色菌落的NGMC分子量大小與[Gpsi-]細(xì)胞的 NGMC分子量大小基本相同，說明這些菌落為被菲啶治愈的[Gpsi-]細(xì)胞。值得注意的是，菲啶作用[GPSI+]細(xì)胞5 d后的白色菌落的NGMC分子量略小于[GPSI+]細(xì)胞，但其朊病毒NGMC仍為聚集狀態(tài) (圖2A)，說明其雖然為[GPSI+]細(xì)胞，但其朊病毒聚集體可能發(fā)生了輕微的解聚。

2.3 蛋白水平菲啶對(duì)酵母朊病毒[GPSI+]治愈作用的定量分析

圖2 熒光焦點(diǎn)法和熒光漂白后恢復(fù)法定量分析菲啶對(duì)酵母朊病毒[GPSI+]的治愈作用Fig. 2 Quantitative analysis of curing effects of phenanthridine on yeast prion [GPSI+] cells with fluorescence foci and FRAP assays. W, R represent white and red phenotype cells respectively. (A) Fluorescence foci assay. (B) Fluorescence redistribution after photobleaching.

為了更為全面地分析菲啶對(duì)酵母朊病毒的作用效果，我們?cè)诘鞍姿嚼冒胱冃原傊悄z電泳 (SDD-AGE) 結(jié)合 Western blotting技術(shù)分析化合物作用后[GPSI+]細(xì)胞內(nèi)的朊病毒NGMC聚集體大小。傳統(tǒng)的SDS-PAGE只能定性檢測(cè)朊病毒能否發(fā)生聚集，而SDD-AGE利用NGMC聚集體大小。傳統(tǒng)的SDS-PAGE只能定性檢測(cè)朊病毒能否發(fā)生聚集，而SDD-AGE利用瓊脂糖凝膠的疏松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及朊病毒聚集體獨(dú)具的 SDS抗性的特點(diǎn)，可以檢測(cè)朊病毒聚集體的大小[12,17]。如圖3所示，[GPSI+]細(xì)胞的朊病毒NGMC主要以大分子聚集體形式存在，少量的以可溶的小分子單體形式存在，而[Gpsi-]細(xì)胞的朊病毒NGMC以可溶的小分子單體形式存在。菲啶作用[GPSI+]細(xì)胞1 d、3 d后的白色菌落的NGMC分子量與[GPSI+]細(xì)胞的基本相似 (圖 3A)，說明這些白色菌落是沒有被治愈的[GPSI+]；菲啶作用3 d、5 d后的紅色菌落的NGMC以單體形式存在，與[Gpsi-]細(xì)胞內(nèi) NGMC大小基本相同(圖3A)，說明這些菌落已為治愈的[Gpsi-]細(xì)胞。另一方面，菲啶作用后5 d的白色菌落的NGMC仍主要為聚集狀態(tài)，但分子量較大的NGMC聚集體發(fā)生了微弱的解聚，并且可溶的NGMC量比[GPSI+]細(xì)胞有少量的增加 (圖3A)，這與前面FRAP實(shí)驗(yàn)所示結(jié)果也是一致的 (圖2B)。此外，對(duì)比圖3A和3B發(fā)現(xiàn)，鹽酸胍作用[GPSI+]細(xì)胞后形成的紅、白菌落中NGMC大小的變化與菲啶作用后的結(jié)果是基本一致的。

圖3 SDD-AGE/Western blotting定量分析菲啶對(duì)酵母朊病毒[GPSI+]的治愈作用Fig. 3 Quantitative analysis of curing effects of phenanthridine on yeast prion [GPSI+] cells with SDD-AGE/Western blotting. The migration of molecular size standards (in kilodaltons) is shown on the left. W, R represent white and red phenotype cells, respectively. (A) Phenanthridine. (B) Guanidine hydrochloride.

2.4 菲啶作用后形成粉色中間表型酵母細(xì)胞中朊病毒聚集狀態(tài)的定量分析

綜上所述，細(xì)胞和蛋白水平的定量分析結(jié)果顯示，菲啶作用[GPSI+]酵母細(xì)胞1 d、3 d、5 d后的白色菌落為非治愈狀態(tài)的[GPSI+]細(xì)胞，而3 d、5 d后的紅色菌落為被治愈的[Gpsi-]細(xì)胞。利用相同的定量研究方法，我們進(jìn)一步分析了菲啶作用后形成的粉色中間表型酵母細(xì)胞中朊病毒NGMC的聚集狀態(tài)。如圖4A所示，熒光焦點(diǎn)實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)菲啶作用[GPSI+]細(xì)胞1 d、2 d后的粉色菌落中的NGMC呈聚集狀態(tài)，3 d、4 d、5 d后的粉色菌落中的NGMC呈可溶狀態(tài)。FRAP結(jié)果顯示菲啶作用[GPSI+]細(xì)胞5 d后的粉色菌落的NGMC大小與[Gpsi-]細(xì)胞的NGMC大小相當(dāng)，1 d后的粉色菌落的NGMC大小與[GPSI+]細(xì)胞的NGMC大小相似，而2 d、3 d、4 d后的粉色菌落的NGMC大小介于兩種對(duì)照細(xì)胞之間 (圖4B)。另一方面，SDD-AGE/Western blotting結(jié)果表明菲啶作用[GPSI+]細(xì)胞3 d、4 d、5 d后的粉色菌落的NGMC主要以單體形式存在；而1 d后的粉色菌落的NGMC主要以聚集體形式存在，與[GPSI+]細(xì)胞的朊病毒聚集體大小相似；2 d后的粉色菌落的NGMC同樣主要以聚集體形式存在，但其分子量略低于[GPSI+]細(xì)胞中的NGMC聚集體，并且可溶的單體NGMC含量明顯增多 (圖 4C)，這與 FRAP的結(jié)果是基本一致的。

圖4 細(xì)胞和蛋白水平定量分析菲啶作用酵母朊病毒[GPSI+]后粉色表型的朊病毒聚集狀態(tài)Fig. 4 Quantitative analysis of the aggregation status of Sup35p in phenanthridine induced pink (P) phenotype cells at the cellular and protein levels. (A) Fluorescence foci. (B) Fluorescene redistribution after photobleaching. (C) SDD-AGE/Western blotting.

3 討論

我們前期研究結(jié)果顯示，5 mmol/L鹽酸胍對(duì)[GPSI+] (NGMC) 菌株的表型治愈效果與 Bach等使用的野生型酵母[PSI+] (NMC) 菌株的效果是相似的[20]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)抗朊病毒化合物菲啶對(duì)酵母朊病毒[GPSI+]的表型治愈作用類似于野生型酵母[PSI+]菌株 (NMC)，這暗示著可以用酵母朊病毒[GPSI+]菌株替代野生型[PSI+]菌株以便利用新的方法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞及蛋白蛋白水平的定量分析。另外，Bach等研究發(fā)現(xiàn)，菲啶單獨(dú)存在只能治愈藥物敏感型酵母朊病毒菌株([PSI+]的強(qiáng)度較弱) 而不能治愈野生型菌株[5]。而藥物敏感型菌株生長(zhǎng)非常緩慢，難于進(jìn)行細(xì)胞及蛋白水平的定量研究。為此，我們借鑒了Bach等提出的使用增效劑鹽酸胍的方法提高本實(shí)驗(yàn)體系中[GPSI+]菌株對(duì)藥物的靈敏度[5]。

借助本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建獨(dú)有的酵母朊病毒[GPSI+]細(xì)胞模型，我們采用 SDD-AGE/Western blotting技術(shù)和 FRAP技術(shù)在蛋白和細(xì)胞水平定量分析了菲啶對(duì)酵母朊病毒的治愈作用，從而彌補(bǔ)了此前研究對(duì)菲啶的抗酵母朊病毒效果缺乏蛋白和細(xì)胞水平定量分析的不足和對(duì)粉色表型沒有精確定量分析的缺陷。研究結(jié)果表明，菲啶作用酵母朊病毒[GPSI+]細(xì)胞1 d、2 d后出現(xiàn)的粉色菌落中朊病毒的聚集狀態(tài)與[GPSI+]相似，而3~5 d后出現(xiàn)的粉色菌落中朊病毒的狀態(tài)與[Gpsi-]相似，呈現(xiàn)出密切的時(shí)間相關(guān)性。結(jié)合前期研究中提出的酵母朊病毒的治愈是通過細(xì)胞分裂降低細(xì)胞質(zhì)中朊病毒“種子”的假說[12-14]，這暗示著菲啶完全治愈[PSI+]需要更多的細(xì)胞分裂周期。另外，值得注意的是，酵母朊病毒的顏色表型與其在細(xì)胞中的聚集狀態(tài)雖然總體上一致，但同時(shí)存在著細(xì)微的區(qū)別。這暗示著在統(tǒng)計(jì)菲啶對(duì)朊病毒的治愈率時(shí)，不能簡(jiǎn)單地認(rèn)為紅色菌落的比例代表了菲啶的治愈率，而應(yīng)根據(jù)不同菌落的系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果來具體分析，因而菲啶作用酵母朊病毒[GPSI+] 1~5 d的治愈率分別為0%、0%、51.7%、87.5%和94.4% (圖1)。此外，本研究結(jié)果也顯示蛋白水平采用的 SDD-AGE/ Western blotting技術(shù)和細(xì)胞水平采用的FRAP技術(shù)在定量研究抗朊病毒候選藥物的作用效果的重要性和可行性，極大地豐富了Bach等提出的基于酵母細(xì)胞的抗朊病毒藥物篩選模型的次級(jí)篩選分析方法。

[1] Prusiner SB. Biology of prion diseases. J Acquir Immune Defic Syndr, 1993, 6(6): 663?665.

[2] Ghaemmaghami S, May BCH, Renslo AR, et al. Discovery of 2-aminothiazoles as potent antiprion compounds. J Virol, 2010, 84(7): 3408?3412.

[3] Sim VL, Caughey B. Recent advances in prion chemotherapeutics. Infect Disord Drug Targets, 2009, 9(1): 81?91.

[4] Trevitt CR, Collinge J. A systematic review of prion therapeutics in experimental models. Brain, 2006, 129(9): 2241?2265.

[5] Bach S, Talarek N, Andrieu T, et al. Isolation of drugs active against mammalian prions using a yeast-based screening assay. Nat Biotechnol, 2003, 21(9): 1075?1081.

[6] Bach S, Tribouillard D, Talarek N, et al. A yeast-based assay to isolate drugs active against mammalian prions. Methods, 2006, 39(1): 72?77.

[7] Tribouillard-Tanvier D, Béringue V, Desban N, et al. Antihypertensive drug guanabenz is active in vivo against both yeast and mammalian prions. PLoS One, 2008, 3(4): e1981.

[8] Zhong ZW, Song YT. Recent advances of research on Antiprion candidate drugs. Chin J Zoonoses, 2011, 27(9): 828?835.鐘正偉, 宋有濤. 朊病毒治療候選藥物的研究進(jìn)展. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào), 2011, 27(9): 828?835.

[9] Song YT, Wu XY, He XR. Development of the model for antiprion drug screening. J Liaoning Univ Nat Sci: Nat Sci Edi, 2009, 37(4): 289?293.宋有濤, 吳憲遠(yuǎn), 何星蓉. 抗朊病毒藥物篩選模型的研究進(jìn)展. 遼寧大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2009, 37(4): 289?293.

[10] Ishikawa T. Recent advances of research on the [PSI+] prion in Saccharomyces cerevisiae. Mycoscience, 2008, 49(4): 221?228.

[11] Tuite MF, Mundy CR, Cox BS. Agents that cause a high frequency of genetic change from [PSI+] to [psi-] in Saccharomy cescerevisiae. Genetics, 1981, 98(4): 691?711.

[12] Kryndushkin DS, Alexandrov IM, Ter-Avanesyan MD, et al. Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104. J Biol Chem, 2003, 278(49): 49636?49643.

[13] Song YT, Wu YX, Jung GM, et al. Role for Hsp70 chaperone in Saccharomyces cerevisiae prion seed replication. Eukaryot Cell, 2005, 4(2): 289?297.

[14] Song Y, Lan WJ, Wu XY, et al. Quantitative effects of magnesium chloride stress on aggregation of Sup35p in [psi-] yeast cells. Protein Pept Lett, 2010, 17(12): 1489?1494.

[15] Wu YX, Greene LE, Masison DC, et al. Curing of yeast [PSI+] prion by guanidine inactivation of Hsp104 does not require cell division. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102(36): 12789?12794.

[16] Wu YX, Masison DC, Eisenberg E, et al. Application of photobleaching for measuring diffusion of prion proteins in cytosol of yeast cells. Methods, 2006, 39(1): 43?49.

[17] Halfmann R, Lindquist SL. Screening for amyloid aggregation by semi-denaturing detergent-agarose gel electrophoresis. J Vis Exp, 2008, 17(1): 1?4.

[18] Greene LE, Park YN, Masison DC, et al. Application of GFP-labeling to study prions in yeast. Protein Pept Lett, 2009, 16(6): 635?641.

[19] Wickner RB. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science, 1994, 264(5158): 566?569.

[20] Song YT, Song Y, Zhong ZW, et al. Illuminating precise quantification in yeast-based model for antiprion compounds screening. 2010 First International Conference on Cellular, Molecular Biology, Biophysics and Bioengineering. Qiqihar: Institute of Electrical and Electronics Engineers Press, 2010, 1: 296?299.