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      山茱萸總苷干預(yù)急性缺氧乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的研究1)

      2012-02-26 01:53:36陳克芳李建軍潘愛珍黃啟輝侯祥平
      關(guān)鍵詞:乳鼠總苷山茱萸

      陳克芳,李建軍,潘愛珍,黃啟輝,侯祥平

      1 材料與方法

      1.1 動物 出生1 d~3 d的SD大鼠,由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

      1.2 試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基,吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司產(chǎn)品;DMEM無糖培養(yǎng)基,Gibco公司產(chǎn)品;胎牛血清,Gbico公司產(chǎn)品;0.25%胰蛋白酶,吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司產(chǎn)品;青霉素-鏈霉素溶液,Gibco公司產(chǎn)品;抗α-Sarcomeric actin,武漢博士德生物有限公司產(chǎn)品;TUNEL-QIA39細(xì)胞凋亡試劑盒,購自Merck公司;SABC試劑盒及DAB顯示試劑盒,購自武漢博士德生物有限公司。

      1.3 藥物 山茱萸,廣東一方制藥有限公司提供。

      1.4 主要儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱,Thermo公司;熒光顯微鏡,Nikon公司。

      1.5 方法

      1.5.1 山茱萸總苷提取物制備 由廣東省中醫(yī)研究所按文獻(xiàn)[1]方法提取,提取物濃縮干燥至粉末狀。

      1.5.2 心肌細(xì)胞原代培養(yǎng) 將出生1 d~3 d的SD大鼠,用75%酒精消毒后取出心臟,迅速放入4℃預(yù)冷D-Hank’s液的培養(yǎng)皿中,洗去心臟表面及血管中的血細(xì)胞,剪去心房和大血管。將心臟剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊,加入約10 m L0.125%胰酶消化液,于37℃水浴箱中分次消化,每次約10 min。收集除第1次以外的細(xì)胞懸液于50 m L離心管中,加入含量為10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液,終止消化。1000 r/min離心5 min,棄上清,加入含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液,輕輕吹打使其形成單細(xì)胞懸液,將細(xì)胞懸液吸入培養(yǎng)皿中,按差速貼壁法于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h,去除成纖維細(xì)胞,純化心肌細(xì)胞。之后輕輕收集尚未貼壁的細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/m L~5×105/m L,接種于6孔培養(yǎng)板中。細(xì)胞于37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng),每2天換一次液,培養(yǎng)3 d~4 d后使用[2]。

      1.5.3 實(shí)驗(yàn)分組 缺氧模型組:正常培養(yǎng)3 d的心肌細(xì)胞棄去培養(yǎng)液,換成無糖DMEM液,用無菌液狀石蠟封住液體表面,使細(xì)胞缺氧[3]。對照組:心肌細(xì)胞不做任何處理,正常條件培養(yǎng)。山茱萸總苷干預(yù)組:細(xì)胞缺氧處理之前24 h在培養(yǎng)液中加入0.49 g/L的山茱萸總苷,缺氧培養(yǎng)的同時亦加入0.49 g/L的山茱萸總苷進(jìn)行干預(yù)。各組設(shè)1 h、2 h、3 h、5 h 4個時間點(diǎn)進(jìn)行指標(biāo)觀察。

      1.5.4 心肌細(xì)胞的鑒定 按照SABC抗α-橫紋肌肌動蛋白試劑盒說明方法:將培養(yǎng)3 d的細(xì)胞爬片,用4%多聚甲醛固定30 min。然后用30%H2O21份+純甲醇50份混合液室溫浸泡30 min后蒸餾水洗1次~2次,滴加5%BSA封閉液,室溫20 min,甩去多余液體,滴加1∶100稀釋的一抗(小鼠抗大鼠α-Sarcomeric actin),對照組用蒸餾水代替一抗,37℃孵育1 h,PBS洗2 min×3次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,室溫20 min,PBS洗2 min×3次。滴加試劑SABC,37℃20 min,PBS洗5 min×4次。二甲苯透明,中性樹膠封片[4]。

      1.5.5 TUNEL檢測心肌細(xì)胞的凋亡率 將培養(yǎng)的細(xì)胞爬片,4%多聚甲醛固定,室溫孵育10 min后,將玻片浸沒在1×TBS溶液中,室溫孵育15 min。每個樣本玻片上滴加50μL~100 μL濃度為20μg/mL的蛋白酶K溶液,室溫孵育5 min。用1×TBS溶清洗樣本2次~3次。滴加100μL×Td T平衡緩沖液,室溫孵育20 min后,在每個樣本上立即滴加60μL Td T標(biāo)記反應(yīng)混合物,置于濕盒中于37℃孵育90 min。將樣本玻片置于1×TBS溶液中室溫孵育1 min。去掉多余液體,換用新鮮1×TBS溶液室溫孵育1 min,重復(fù)1次。用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的TBS溶液,逐滴滴加Mounting Media封片劑并蓋上 蓋玻片。使用熒光顯微鏡分別用330 nm~380 nm及465 nm~495 nm波長下激發(fā)熒光,計(jì)數(shù)所有細(xì)胞和凋亡細(xì)胞,計(jì)算出凋亡率[5]。

      1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,圖片制作采用SPSS13.0及EXCEL進(jìn)行,計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組計(jì)量數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn),多組數(shù)據(jù)之間的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),檢驗(yàn)水平取α=0.05。

      2 結(jié) 果

      2.1 心肌細(xì)胞培養(yǎng) 在倒置相差顯微鏡下觀察,培養(yǎng)24 h后,細(xì)胞已基本貼壁,并伸出偽足,形態(tài)呈梭形、菱形或不規(guī)則多邊形。培養(yǎng)72 h后,心肌細(xì)胞融合成片,形成單細(xì)胞層,細(xì)胞搏動呈現(xiàn)同步化,每分鐘120次左右。

      2.2 心肌細(xì)胞鑒定 心肌細(xì)胞中含有α-Sarcomeric actin,本實(shí)驗(yàn)選用的一抗為小鼠抗大鼠α-橫紋肌肌動蛋白,因此染色后心肌細(xì)胞胞漿將被著深棕色,而非心肌細(xì)胞則呈陰性染色。心肌細(xì)胞的純度鑒定采用每張玻片隨機(jī)取10個視野,分別計(jì)算出心肌細(xì)胞陽性率,重復(fù)3次并取平均值為97.26%、96.875%、96.97%,三者取平均值為97.035%,因此本實(shí)驗(yàn)心肌細(xì)胞的純度為97.035%。

      2.3 TUNEL檢測心肌細(xì)胞的凋亡率(見表1) 正常對照組心肌細(xì)胞凋亡率極低。而在心肌細(xì)胞缺氧2 h后凋亡率明顯增高 ,3 h~5 h后達(dá)到高峰,與對照組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。用山茱萸總苷干預(yù)治療后,治療組與缺氧組相比凋亡率明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

      表1 各組心肌細(xì)胞的凋亡率比較( ±s) %

      表1 各組心肌細(xì)胞的凋亡率比較( ±s) %

      組別 凋亡率對照組 0.55±0.05缺氧組 1 h 16.22±1.001)2 h 60.81±3.311)3 h 96.12±1.331)5 h 98.77±0.431)治療組 1 h 4.06±0.252)2 h 10.14±0.622)3 h 15.27±1.182)5 h 27.53±1.282)與對照組比較,1)P<0.01;與缺氧組相比,2)P<0.01

      2.4 山茱萸總苷干預(yù)急性缺血乳鼠心肌細(xì)胞TUNEL染色結(jié)果 對照組正常心肌細(xì)胞陽性著色的細(xì)胞核很少;隨著缺氧時間延長,陽性著色比例較對照組組明顯增多;治療組較缺氧組陽性著色比例明顯減少。

      3 討 論

      長期以來,細(xì)胞壞死一直被認(rèn)為是缺血性心肌死亡的唯一方式[6]。但是最近研究結(jié)果顯示,急性心肌梗死時早期心肌細(xì)胞死亡的主要方式為細(xì)胞凋亡,而不是心肌細(xì)胞的壞死,并且心肌梗死晚期也存在心肌細(xì)胞的凋亡[7,8]。心肌細(xì)胞凋亡與壞死是完全不同的,有研究[9]證實(shí)細(xì)胞凋亡于心肌缺血2 h后發(fā)生,4 h~5 h時最明顯,6 h后開始減少,這點(diǎn)在本研究中也得到了驗(yàn)證。結(jié)果顯示,原代培養(yǎng)的SD乳鼠心肌細(xì)胞在正常情況下幾乎沒有心肌細(xì)胞的凋亡,但在缺氧時可以引起心肌細(xì)胞的凋亡,并且隨著缺氧時間的延長,凋亡細(xì)胞不斷增加,缺氧5 h時達(dá)到最高,凋亡率幾乎達(dá)到98%。因此,防治心肌細(xì)胞凋亡是治療急性心肌梗死新的治療靶點(diǎn)。

      現(xiàn)代藥理研究表明,山茱萸總苷有抗炎和殺菌作用[10],抗氧化損傷作用[11],對急性缺血缺氧的心肌具有保護(hù)作用[12]。急性心肌缺血時線粒體的能量耗竭及活性氧的釋放是導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡和壞死的主要病理改變,已有研究證實(shí),中藥山茱萸對于實(shí)驗(yàn)性心肌梗死大鼠模型的心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),給予山茱萸總苷干預(yù)后,缺氧乳鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯下降,而且各個時間點(diǎn)的凋亡率均降低??梢娚杰镙强傑湛梢砸种菩募〖?xì)胞的凋亡,保護(hù)缺氧心肌細(xì)胞。但山茱萸總苷通過什么作用途徑抑制心肌細(xì)胞凋亡,尚需深入研究。

      [1]吳紅,梁恒,劉永紅,等.山茱萸總皂苷的提取分離與含量測定[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,24(5):430.

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