余春磊劉家嫻，2齊國(guó)昌羅小嬌劉新春馮宗云*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物遺傳育種學(xué)系大麥研究中心，四川溫江611130; 2.四川甘孜藏族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，四川康定626000)

IT－ISJ標(biāo)記及其在大麥遺傳多樣性研究中的應(yīng)用

余春磊1劉家嫻1，2齊國(guó)昌1羅小嬌1劉新春1馮宗云1*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物遺傳育種學(xué)系大麥研究中心，四川溫江611130; 2.四川甘孜藏族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，四川康定626000)

本研究首次利用一種新的分子標(biāo)記IT－ISJ(Intron－targeted intron－exon splice junction，內(nèi)含子－外顯子拼接位點(diǎn))對(duì)34份來自中國(guó)青藏高原、歐洲和北美的栽培青稞品種(系)進(jìn)行了多態(tài)性分析。結(jié)果表明:20對(duì)引物組合共擴(kuò)增出87條條帶，平均每對(duì)引物組合4.35條條帶。其中81條具有多態(tài)性，多態(tài)性條帶為93.10%。共擴(kuò)增出134個(gè)等位變異，變幅為2～11個(gè)，平均每個(gè)引物對(duì)檢測(cè)到6.7個(gè)。34份材料間的遺傳相似系數(shù)(GS)變幅在0.437～0.931之間，平均為0.743±0.094。材料間平均遺傳距離較低，僅為0.257，遺傳多樣性在0.2509～0.8460之間，平均為0.59。本結(jié)果表明IT－ISJ標(biāo)記能有效用于大麥遺傳多樣性分析、品種鑒定，遺傳圖譜構(gòu)建及分子標(biāo)記輔助選擇育種中。因此，大麥育種者在雜交育種中應(yīng)廣泛發(fā)現(xiàn)和挖掘優(yōu)異青稞資源，擴(kuò)大青稞種質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)，提高青稞育種效率。

大麥;青稞;IT－ISJ;遺傳多樣性

大麥(Hordeumvulgare L.)是世界上最古老的栽培作物之一，具有早熟、抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性廣等特性，主要用作牲畜飼料、啤酒工業(yè)原料，還具有釀造、美容、食用、保健等多種用途，已受到大麥育種者及食品加工企業(yè)的高度關(guān)注。多種分子標(biāo)記的開發(fā)，有利于大麥高密度分子遺傳圖譜的構(gòu)建、基因定位、QTL作圖、遺傳多樣性評(píng)價(jià)、標(biāo)記輔助選擇育種及品種鑒定等研究。在大麥上，應(yīng)用較多的分子標(biāo)記包括RAPD、RFLP、SSR、AFLP等，SRAP應(yīng)用較少［1，9］。但這些分子標(biāo)記各有其優(yōu)缺點(diǎn)。尋找設(shè)計(jì)引物簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性高的新標(biāo)記是大麥育種及分子生物學(xué)者努力追求的目標(biāo)。

IT－ISJ(Intron－targeted intron－exon splice junction，內(nèi)含子－外顯子拼接位點(diǎn))標(biāo)記是鄭靚等(2008)［2］根據(jù)植物基因內(nèi)含子剪接位點(diǎn)保守序列參照Weining and Langridge(1991)［8］的方法設(shè)計(jì)合成的。具體為前引物的核心部分為5’端剪接位點(diǎn)保守序列CAGGTAACT，并在其5’端和3’端分別加上限制性內(nèi)切酶SPhl的識(shí)別序列GCATGC和3個(gè)選擇性堿基。后引物的核心部分為3’端剪接位點(diǎn)保守序列ACCTGCA，并在其5’端和3’端分別加上限制性內(nèi)切酶EcoRI的識(shí)別序列GAATTC和任意3個(gè)選擇堿基。此標(biāo)記已在棉花［2］、花生［3］、蘋果［4］中應(yīng)用于品種鑒定、構(gòu)建遺傳圖譜、遺傳多樣性分析，具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、成本低等優(yōu)點(diǎn)。但該標(biāo)記應(yīng)用于大麥上尚未見報(bào)道。

本研究以栽培青稞品種(系)為材料，采用IT－ISJ標(biāo)記技術(shù)分析了該標(biāo)記在大麥中應(yīng)用的可行性，并評(píng)價(jià)了這些材料間的遺傳關(guān)系，可為大麥育種、品種鑒定、新品種保護(hù)與利用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

供試材料共34份，包括西藏材料9份(XZ1－XZ9)、甘肅材料5份(GS1－GS5)、四川材料5份(SC1－SC5)及9份青海材料(QH1－QH9)和6份國(guó)外材料(AB1－AB6)。其名稱及來源見表1。這些材料現(xiàn)保存于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)大麥研究中心。

1.2方法

1.2.1 gDNA的提取。gDNA提取采用CTAB法［6］。每份材料取新鮮健康的幼葉約300 mg，置于液氮中迅速研磨至粉末，隨后將粉末轉(zhuǎn)移到2 ml離心管中，加入800μL65℃預(yù)熱的2× CTAB提取液［0.2 mmol/L Tris－HCL(PH約8.0)，0.02 mmol/L EDTA，55 mmol/L CTAB，2%β－巰基乙醇)］于65℃水浴至少50 min，期間輕輕顛倒混勻幾次，取出離心管冷卻至室溫，然后加入800μL氯仿:異戊醇(24:1)輕搖10 min后靜置30 min，11 000 r/min離心15 min，取上清液加入等體積的異丙醇沉淀DNA，用70%乙醇沖洗2次，90%乙醇再?zèng)_洗1次，干燥后加入50μl滅菌的ddH2O，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度與質(zhì)量。將DNA稀釋至20 ng/μL于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 IT－ISJ反應(yīng)體系。PCR引物(表2)采用鄭靚等［2］已發(fā)表的引物，由上海英捷貿(mào)易有限公司合成。引物組合以正反向引物名稱的最后兩個(gè)字母組合表示。PCR擴(kuò)增通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)選出最佳體系，總體積20μL，包括20 ng/μL模板DNA 2μL，1.5 mmol/L的MgCl2，0.2 mmol/L的dNTPs，0.5μmol/L引物，1U Taq聚合酶，2μL 10×PCR buffer。在PTC－200擴(kuò)增儀上完成。反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，53℃退火45 s，72℃延伸lmin，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。

表1 供試栽培青稞品種(系)名稱、編號(hào)及來源

表2 IT－ISJ引物名稱及核苷酸序列

1.2.3擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物加3×Loading-Buffer 10μL，95℃變性5 min后，用預(yù)熱30 min的8%變性聚丙烯酰胺凝膠恒功率75 w電泳，至指示劑離膠板底部三分之一處(約45 min)，取下膠板。采用銀染法檢測(cè)［5］。用數(shù)碼相機(jī)拍照，統(tǒng)計(jì)帶型。

1.2.4數(shù)據(jù)的處理。對(duì)IT－ISJ擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果采用0、1、－9統(tǒng)計(jì)建立數(shù)據(jù)庫(kù)，在相同遷移位置有帶記為1，無帶記為0，模糊不清或其他原因記為－9。遺傳多樣性指數(shù)(H)按H=1－∑Pi2(Nei等，1979)［7］計(jì)算，其中Pi為某座位第i個(gè)等位變異的頻率。利用NTSYS－pc統(tǒng)計(jì)分析軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)(GS)。計(jì)算公式為:GS= 2Nij/(Ni+Nj)，其中Nij為材料i和j共有的擴(kuò)增片段數(shù)，Ni為材料i中出現(xiàn)的擴(kuò)增片段數(shù)，Nj為材料j中出現(xiàn)的擴(kuò)增片段數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1引物組合篩選

用10個(gè)正向引物和12個(gè)反向引物組成的120對(duì)引物組合，對(duì)選取的兩個(gè)品種(北青2號(hào)、北青3號(hào))進(jìn)行多態(tài)性篩選，其中74對(duì)引物能擴(kuò)增出條帶，占引物組合總數(shù)的61.67%。有55對(duì)引物組合能擴(kuò)增出多態(tài)性，多態(tài)性比例占45.83%。并用相同引物對(duì)和模板進(jìn)行多次擴(kuò)增和電泳，其帶型沒有變化，表明IT－ISJ標(biāo)記在大麥上具有較好的重現(xiàn)性。從這55對(duì)引物中選取擴(kuò)增性較好、重復(fù)性較高的20對(duì)引物對(duì)所有材料進(jìn)行多態(tài)性分析，統(tǒng)計(jì)在100～2 000 bp之間能夠清晰可辨的電泳條帶。其中，引物組合IT－ISJ02F47R可區(qū)分11個(gè)品種，而引物組合IT－ISJ08F52R、ITISJ08F54R、IT－ISJ08F55R和IT－ISJ11F54R各自能區(qū)分10個(gè)品種。特別是可用5個(gè)引物組合(IT－ISJ02F08R、IT－ISJ02F42R、IT－ISJ08F52R、IT－ISJ08F54R、IT－ISJ08F55R)就能將本試驗(yàn)中的34份材料區(qū)分開，占引物組合總數(shù)的25.00%。

2.2多態(tài)性分析

圖1為引物組合IT－ISJ05F18R擴(kuò)增產(chǎn)物部分電泳圖。發(fā)現(xiàn)不同的引物對(duì)擴(kuò)增的條帶數(shù)、擴(kuò)增帶型都不同(表3)。從表3看出，在總樣本中，20對(duì)引物組合共產(chǎn)生清晰可辨的條帶數(shù)為1～8條，大部分在4條以上，總計(jì)87條，平均每個(gè)引物對(duì)4.35條，其中81條具有多態(tài)性，平均多態(tài)性條帶為4.05條，多態(tài)性條帶為93.10%。在這20對(duì)引物中，3個(gè)引物對(duì)IT－ISJ02F18R、ITISJ11F46R、IT－ISJ05F18R的多態(tài)性條帶比率分別為50.00%、60.00%、71.42%，其余17對(duì)引物的多態(tài)性條帶比率為100%。這表明IT－ISJ標(biāo)記適合于對(duì)大麥進(jìn)行DNA多態(tài)性分析。

圖1 引物組合IT－ISJ05F18R擴(kuò)增產(chǎn)物部分電泳圖(M:DL2000;1:喜馬拉雅2號(hào);2:喜馬拉雅4號(hào); 3:喜馬拉雅5號(hào);4:喜馬拉雅6號(hào);5:喜馬拉雅10號(hào); 6:喜馬拉雅16號(hào);7:喜馬拉雅17號(hào);8:喜馬拉雅19號(hào);9:喜馬拉雅22號(hào);10:甘青4號(hào);11:甘青5號(hào); 12:9619;13:9640;14:9718;15:白六棱)

2.3等位變異與遺傳相似性

從表3可知，20對(duì)引物共擴(kuò)增出134個(gè)等位變異(帶型)，變幅在2～11個(gè)，平均每個(gè)引物對(duì)檢測(cè)到6.70個(gè)。34份材料間的遺傳相似系數(shù)(GS)變幅在0.437～0.931之間，平均為0.743± 0.094。其中，l來自墨西哥的CI－424(AB4)和北青3號(hào)系選的SC5間相似系數(shù)最小(0.436)，而北青1號(hào)(QH2)和北青2號(hào)(QH3)間相似系數(shù)最大，達(dá)0.931。供試材料中，相似系數(shù)＜0.75的材料組合有238個(gè)，占組合總數(shù)的42.42%，相似系數(shù)＞0.75的材料組合有323個(gè)，占所有供試組合的57.58%。材料間平均遺傳距離較低，僅為0.257，遺傳多樣性在0.2509～0.8460之間，平均為0.59。這表明供試材料間的遺傳差異較小。

表3 IT－ISJ引物組合的多態(tài)性與等位變異

3討論與小結(jié)

IT－ISJ(intron targe red intron－exon splice junction，內(nèi)含子－外顯子拼接位點(diǎn))DNA分子標(biāo)記技術(shù)是近年來由鄭靚等(2008)［2］開發(fā)出的，具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便、操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，已在陸地棉［2］、花生［3］、蘋果［4］上有報(bào)道。但該標(biāo)記應(yīng)用于大麥上還未見報(bào)道。在本研究中，我們首次用IT－ISJ的10個(gè)正向引物和12個(gè)反向引物組成120對(duì)引物，對(duì)選取的2個(gè)青稞品種(北青2號(hào)、北青3號(hào))進(jìn)行了引物對(duì)的篩選。篩選出多態(tài)性較高、帶型豐富、條帶清晰的引物組合55個(gè)，占引物組合總數(shù)的45.83%，遠(yuǎn)高于紀(jì)君超等(2010)［4］在加工蘋果品種中報(bào)道的結(jié)果。從55對(duì)引物組合中選取20對(duì)引物組合對(duì)34份青稞品種(系)進(jìn)行了多態(tài)性分析，共擴(kuò)增出87條帶，其中多態(tài)性帶81條，平均每對(duì)引物組合擴(kuò)增出4.05條帶，多態(tài)性百分率為93.10%。而多態(tài)性高達(dá)100%的引物組合數(shù)達(dá)17個(gè)，占85.00%，明顯高于鄭靚等(2008)［2］在陸地棉、于樹濤等(2009)［3］在花生上及紀(jì)君超等(2010)［4］在蘋果中所得結(jié)果。在這20對(duì)引物中，3個(gè)引物對(duì)IT－ISJ02F18R、IT－ISJ11F46R、ITISJ05F18R的多態(tài)性條帶比率分別為50.00%、60%、71.42%。從圖1和表3看出，不同的引物對(duì)擴(kuò)增的條帶數(shù)、擴(kuò)增帶型都不同。引物組合IT－ISJ02F47R可區(qū)分11個(gè)品種，而引物組合ITISJ08F52R、IT－ISJ08F54R、IT－ISJ08F55R和IT－ISJ11F54R各自能區(qū)分10個(gè)品種。特別是僅用5個(gè)引物組合(IT－ISJ02F08R、IT－ISJ02F42R、IT－ISJ08F52R、IT－ISJ08F54R、IT－ISJ08F55R)就能將本試驗(yàn)中的34份材料區(qū)分開，占引物組合總數(shù)的25.00%。上述結(jié)果表明，采用IT－ISJ引物組合對(duì)青稞品種(系)能擴(kuò)增得到條帶清晰、穩(wěn)定性較好、多態(tài)性較高的條帶、且操作簡(jiǎn)單、成本較低，這表明IT－ISJ標(biāo)記應(yīng)用在大麥上是可行的，將在大麥遺傳多樣性分析、品種鑒定，遺傳圖譜構(gòu)建及分子標(biāo)記輔助選擇育種中得到廣泛的應(yīng)用。

34份材料間的遺傳相似系數(shù)(GS)變幅在0.437～0.931之間，平均為0.743±0.094。供試材料中，相似系數(shù)＜0.75的材料組合有238個(gè)，占組合總數(shù)的42.42%，相似系數(shù)＞0.75的材料組合有323個(gè)，占所有供試組合的57.58%。材料間平均遺傳距離僅為0.257，平均遺傳多樣性為0.59。這表明供試材料間的遺傳差異較小，遺傳基礎(chǔ)較窄，遺傳關(guān)系較近。因此，大麥育種者在雜交育種中應(yīng)廣泛發(fā)現(xiàn)和挖掘優(yōu)異青稞資源，擴(kuò)大青稞種質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)，提高青稞育種效率。

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IT－ISJM arkers and Its Application to the Genetic Diversity in Barley

YU Chun－Lei1，LIU Jia－Xian1，2，QIGuo－Chang1，LUO Xiao－Jiao1，LIU Xin－Chun1，F(xiàn)ENG Zong－Yun1
(1．Barley Research Centre，Department of Plant Genetics and Breeding，College of Agronomy，Chengdu Campus，Sichuan Agricultural University，Wenjiang 611130，China;2．Ganzi Institute of Agricultural Sciences，Cangding 626000，China)

IT－ISJ(Intron－targeted intron－exon splice junction)，a new molecularmarker，themolecular polymorphism of 34 cultivated hulless barley cultivars(lines)from the Qinghai－Tibet Plateau of China，the Europe and the North America，which was reported firstly in this study．The result showed that，20 primer combinations produced a total of87 clear bandswith an average of4．35 bands per primer pair，and which 81bands(93．10%)were polymorphic．134 alleles，ranged from 2 to 11，were amplified with an average of 6．7 alleles per primer pair．Genetic similarities ranged from 0．437 to 0．931，with an average of 0．743．The average genetic distance(0．257)was lower among accessions and average genetic diversity(0．59)，so the result indicated that the genetic basis is narrower among accessions．Based on the results，IT－ISJmarker could be effectively used in researching genetic diversities，cultivar identifications，construction of geneticmap and molecularmarker－assisted selection breeding．Therefore，it is very essential that the excellent hulless barley genetic resources should be extensively discovered and excavated to widen the genetic basis of hulless barley genetic resources and increase the efficiency in hulless barley breeding．

Barley;Hulless Barley;IT－ISJMarker;Genetic Diversity

2012－11－11

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)基金(CARS－05)、四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)科技成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)基金。

同等貢獻(xiàn)作者簡(jiǎn)介:余春磊(1989－)，男，在讀碩士生，主要從事大麥育種與分子生物學(xué)研究。

劉家嫻(1983－)，女，農(nóng)業(yè)推廣碩士，助理農(nóng)藝師，主要從事青稞栽培與育種研究工作。

*通訊作者:馮宗云(1963－)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事大麥遺傳育種及分子生物學(xué)研究。