堵安慶 王羽 趙森 李煒鵬 趙志河

（1.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院 正畸科；2.口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川大學(xué)，成都610041；3.中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院 正畸科；4.廣東省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510055）

頜面部骨組織的生長(zhǎng)改建受口腔應(yīng)力環(huán)境的影響，例如：偏側(cè)咀嚼可使常用側(cè)下頜骨強(qiáng)壯、廢用側(cè)變?nèi)?，義齒修復(fù)可延緩牙槽骨吸收，正畸力可影響牙移動(dòng)等。因此，研究骨細(xì)胞在應(yīng)力作用下的反應(yīng)對(duì)了解頜面部骨組織的生長(zhǎng)改建機(jī)制具有重要意義。c-fos基因是即刻早期基因家族中的重要成員，能對(duì)各種細(xì)胞外刺激迅速作出反應(yīng)。有研究[1]指出：c-fos基因是骨樣細(xì)胞對(duì)機(jī)械應(yīng)力刺激反應(yīng)的標(biāo)記物。在正常細(xì)胞中，該基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平都較低，而在應(yīng)力等刺激因素作用下表達(dá)增高，被視為細(xì)胞力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的重要信號(hào)分子。另有研究[2-3]表明：細(xì)胞骨架參與了力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中c-fos基因的表達(dá)，是應(yīng)力誘導(dǎo)c-fos基因高表達(dá)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。對(duì)于成骨細(xì)胞c-fos基因和細(xì)胞骨架絲狀肌動(dòng)蛋白（filamentous actin，F(xiàn)-actin）在周期性張應(yīng)力作用下相互關(guān)系的研究還很罕見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)擬從此方面進(jìn)行探討，以期初步了解骨細(xì)胞在應(yīng)力作用下的應(yīng)答反應(yīng)機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 成骨樣細(xì)胞MG-63的培養(yǎng)

將MG-63細(xì)胞按每毫升1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于聚苯乙烯培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%融合時(shí)，按1∶1的比例傳代培養(yǎng)。

1.2 MG-63細(xì)胞加力

參照本課題組前期的研究方法[4]對(duì)MG-63細(xì)胞加力。加力板由聚苯乙烯培養(yǎng)瓶切割而成，大小為4 cm×8 cm，厚度為1.15 mm。要求加力板周緣平滑、四角圓鈍，以避免加力過(guò)程中出現(xiàn)應(yīng)力集中。

采用傳代后的細(xì)胞，消化離心后按每毫升1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于加力板中1/3區(qū)域（實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組同時(shí)種板），每板接種1 mL細(xì)胞懸液（即每板含1×105個(gè)細(xì)胞），置入培養(yǎng)皿中，于37 ℃孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)4 h后，鏡下觀察待細(xì)胞完全貼壁后，加入20 mL培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。加載前24 h，更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，以同步化細(xì)胞周期。

采用Forcel四點(diǎn)彎曲加力裝置，對(duì)接種在加力板上的MG-63細(xì)胞施加周期性張應(yīng)力，頻率為0.5 Hz，細(xì)胞應(yīng)變?yōu)? 000 μstrain，按3、6、12 h不同時(shí)間段加力，使細(xì)胞在平行于貼壁方向上發(fā)生單軸牽張應(yīng)變，每組重復(fù)3次。對(duì)照組不加力。每組3個(gè)樣本均來(lái)自同一瓶培養(yǎng)細(xì)胞，以相同的密度和細(xì)胞量接種，除應(yīng)力影響因素外，其他條件基本一致。

1.3 c-fos mRNA的熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)

用Trizol提取各組細(xì)胞的總RNA。熒光定量PCR擴(kuò)增前，隨機(jī)抽取3個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本的總RNA各5 μL，1%瓊脂糖凝膠電泳30 min，觀察28S和18S rRNA條帶的亮度，測(cè)量260 nm和280 nm處的光密度（optical density，OD）值，計(jì)算二者的比值，觀察有機(jī)物的污染情況。將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后行熒光定量PCR檢測(cè)，檢測(cè)MG-63細(xì)胞在不同加力時(shí)間內(nèi)c-fos mRNA的表達(dá)情況。

熒光定量PCR具體步驟如下。1）預(yù)混合下列溶液于PCR反應(yīng)管中，包括10×buffer（不含Mg2+）3 μL、MgCl2（25 mmol·L-1）3 μL、dNTP（25 mmol·L-1）0.36 μL、正向引物（10 μmol·L-1）1 μL、反向引物（10 μmol·L-1）1 μL、SYBR Green Ⅰ核酸凝膠染液（10 μmol·L-1）2 μL、Taq聚合酶（5 U·μL-1）0.3 μL、ddH2O 17.34 μL、cDNA模板2 μL，總體積30 μL。2）反應(yīng)體系在FTC-2000型熒光定量PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增條件如下：94 ℃2 min；94 ℃20 s、52 ℃20 s、72 ℃30 s、80 ℃20 s，共45個(gè)循環(huán)。3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線確定每個(gè)樣品管中熒光強(qiáng)度增加到閾值時(shí)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)Ct。用2-ΔΔCt[5]計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)相對(duì)于0 h基因表達(dá)的比值。cfos和GAPDH的引物序列如下。c-fos正向引物：5’-gcgcagagcattggcagga-3’，反向引物：5’-cctcagcttggcaatct-3’；GAPDH正向引物：5’-gggtgtgaaccatgagaagt-3’，反向引物：5’-ccaaagttgtcatggatgacct-3’。

1.4 F-actin的激光掃描共聚焦檢測(cè)

選取c-fos基因表達(dá)高峰的時(shí)間點(diǎn)3 h為實(shí)驗(yàn)組，以0 h組樣本為對(duì)照，進(jìn)行F-actin和二脒基苯基吲哚（diamidino-phenyl-indole，DAPI）的免疫熒光雙染色，步驟如下：1）3.7%多聚甲醛固定樣本15 min，PBS漂洗3次，每次5 min，5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）37 ℃封閉30 min；2）滴加5 μg·mL-1的F-actin染色劑鬼筆環(huán)肽-異硫氰酸熒光素（phalloidinfluorescein isothiocyanate，phalloidin-FITC）（Sigma公司，美國(guó)）于加力板中1/3區(qū)域，37 ℃濕盒內(nèi)避光孵育60 min，PBS漂洗3次，每次5 min，避光保存；3）滴加5 μg·mL-1的細(xì)胞核染色劑DAPI于加力板中1/3區(qū)域，室溫避光染色5 min；PBS漂洗3次，每次5 min，避光保存。染色完成后在激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，LSCM）（Leica公司，德國(guó)，TCS SP2型）下觀察，打開激光發(fā)生器掃描樣本，所有檢測(cè)按同樣的系統(tǒng)設(shè)置來(lái)完成。FITC和DAPI的激發(fā)光波長(zhǎng)分別為495 nm和370 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)分別為520 nm和455 nm；綠色染色為F-actin，藍(lán)色染色為細(xì)胞核。檢測(cè)后應(yīng)用Image J 1.44e圖像處理軟件隨機(jī)對(duì)每一加力板上的6個(gè)細(xì)胞進(jìn)行圖像分析，測(cè)量F-actin的熒光強(qiáng)度（單位面積的熒光顆粒數(shù)），每組重復(fù)測(cè)量3次。

1.5 細(xì)胞松弛素D對(duì)c-fos基因表達(dá)和F-actin的影響

將細(xì)胞接種在加力板上，培養(yǎng)48 h并同步化后，用含有微絲細(xì)胞骨架解聚劑細(xì)胞松弛素D（cytochalasin D）的DMEM培養(yǎng)基（質(zhì)量濃度為0.1 μg·mL-1）孵育1 h后再對(duì)細(xì)胞施加周期性張應(yīng)力，頻率為0.5 Hz，細(xì)胞應(yīng)變?yōu)? 000 μstrain，時(shí)間為3 h。對(duì)照組為相同時(shí)間的單純加力組。加力后收集樣本，進(jìn)行c-fos mRNA熒光定量PCR檢測(cè)和F-actin及DAPI免疫熒光雙染色，觀察二者的表達(dá)變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。3組及3組以上的樣本數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，如差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，再行SNK檢驗(yàn)；兩組數(shù)據(jù)間的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MG-63細(xì)胞加力和RNA提取

加力3、6、12 h后，收集各組細(xì)胞的培養(yǎng)液，鏡下觀察均未見(jiàn)細(xì)胞，證明加力沒(méi)有造成細(xì)胞的死亡和脫落。各組細(xì)胞總RNA樣品條帶清晰，28S rRNA的條帶亮度大于18S，OD260nm/OD280nm值為1.95，表明RNA提取質(zhì)量良好，沒(méi)有蛋白質(zhì)等有機(jī)物的污染。

2.2 周期性張應(yīng)力作用下MG-63細(xì)胞中c-fos mRNA的表達(dá)變化

在2 000 μstrain周期性張應(yīng)力作用下，MG-63細(xì)胞中c-fos mRNA表達(dá)的情況見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)：MG-63細(xì)胞中c-fos mRNA表達(dá)增加，至3 h達(dá)到峰值，然后逐漸下降，到12 h降至正常水平。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，c-fos mRNA在3 h的表達(dá)明顯高于0 h（P＜0.01），6 h的表達(dá)也高于0 h（P＜0.05），12 h的表達(dá)與0 h的差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。這表明周期性張應(yīng)力可以誘導(dǎo)c-fos mRNA出現(xiàn)短暫、一過(guò)性的表達(dá)。選取c-fos基因表達(dá)高峰的時(shí)間點(diǎn)3 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 周期性張應(yīng)力作用下，MG-63細(xì)胞中c-fos mRNA的變化Fig 1 The change of c-fos mRNA in MG-63 osteoblasts under cyclic tensile stress

2.3 周期性張應(yīng)力作用下MG-63細(xì)胞中F-actin的表達(dá)情況

F-actin的激光掃描共聚焦觀察結(jié)果見(jiàn)圖2：0 h組可見(jiàn)F-actin包繞細(xì)胞核排列，細(xì)胞核區(qū)有少量分布，呈染色均勻一致的膜狀結(jié)構(gòu)，無(wú)明顯的方向性（圖2A）；3 h組F-actin在細(xì)胞內(nèi)聚集形成應(yīng)力纖維，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)明顯的非極性并行排列的應(yīng)力纖維，細(xì)胞體牽拉，邊緣粗糙不規(guī)整，出現(xiàn)鋸齒樣結(jié)構(gòu)（圖2B）。F-actin的平均熒光強(qiáng)度值見(jiàn)圖3：經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)分析，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)F-actin的熒光強(qiáng)度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)合圖2、3可以看出：隨著應(yīng)力的加載，F(xiàn)-actin微絲蛋白的量并沒(méi)有改變，只是出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)上的重組。

圖2 MG-63細(xì)胞中F-actin的表達(dá) LSCM×400Fig 2 The expression of F-actin in MG-63 osteoblastsLSCM×400

圖3 MG-63細(xì)胞中F-actin的平均熒光強(qiáng)度Fig 3 The mean fluorescence intensity values of F-actin in MG-63 osteoblasts

2.4 細(xì)胞松弛素D對(duì)c-fos mRNA和F-actin表達(dá)的影響

加入細(xì)胞松弛素D后，鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞仍然貼壁生長(zhǎng)，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的加力要求。c-fos mRNA表達(dá)的變化見(jiàn)圖4：與單純加力組相比，加入細(xì)胞松弛素D后c-fos mRNA的表達(dá)明顯降低（P＜0.01），提示細(xì)胞松弛素D對(duì)張應(yīng)力誘導(dǎo)的c-fos mRNA表達(dá)有抑制作用。激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察可見(jiàn)：經(jīng)細(xì)胞松弛素D處理后的MG-63細(xì)胞體內(nèi)形成的應(yīng)力纖維明顯減少（圖5）。F-actin的熒光強(qiáng)度值見(jiàn)圖6，可見(jiàn)經(jīng)細(xì)胞松弛素D處理后，F(xiàn)-actin的熒光強(qiáng)度明顯降低（P＜0.01）。

圖4 周期性張應(yīng)力作用下加入細(xì)胞松弛素D對(duì)c-fos mRNA表達(dá)的影響Fig 4 The change of c-fos mRNA expression after treated by cytochalasin D under cyclic tensile stress

圖5 細(xì)胞松弛素D對(duì)F-actin表達(dá)的影響 LSCM×400Fig 5 The change of F-actin expression after treated by cytochalasin D LSCM×400

圖6 加入細(xì)胞松弛素D后F-actin的平均熒光強(qiáng)度Fig 6 The mean fluorescence intensity values of F-actin after treated by cytochalasin D

3 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在周期性張應(yīng)力作用下，MG-63細(xì)胞中c-fos mRNA的表達(dá)增加，至3 h達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，12 h降至正常水平。該結(jié)果與Kletsas等[1]的研究結(jié)果一致。Kletsas等[1]研究表明：周期性應(yīng)力加載0.5 h后c-fos出現(xiàn)表達(dá)，至3 h達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，12 h降至正常水平。這表明周期性張應(yīng)力可以誘導(dǎo)c-fos mRNA呈現(xiàn)短暫、一過(guò)性的表達(dá)。

本研究結(jié)果顯示：在應(yīng)力加載作用下，F(xiàn)-actin微絲蛋白的量并沒(méi)有明顯變化，只是出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)上的重組。從量上來(lái)說(shuō)，F(xiàn)-actin似乎是穩(wěn)定的，并沒(méi)有隨著應(yīng)力的加載而出現(xiàn)動(dòng)態(tài)改變。這與其他學(xué)者[6-7]的研究結(jié)果不同。但Knight等[8]的研究也得出了與本實(shí)驗(yàn)類似的結(jié)果。Knight等[8]認(rèn)為：在壓應(yīng)力作用下，與F-actin結(jié)合的蛋白和鈣調(diào)節(jié)蛋白被激活，引起Factin重組；發(fā)生重組時(shí)，沒(méi)有出現(xiàn)F-actin基因表達(dá)的變化，表明重組的是既有的F-actin。還有研究[9-10]證實(shí)：力學(xué)刺激是通過(guò)F-actin的重組來(lái)作用于細(xì)胞的。重組暫時(shí)改變了細(xì)胞的力學(xué)特性，通過(guò)這種反饋機(jī)制，細(xì)胞得以受到生理負(fù)荷的調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)-actin的重組使MG-63細(xì)胞發(fā)生形變，可見(jiàn)細(xì)胞受到了力學(xué)載荷的調(diào)節(jié)。

細(xì)胞松弛素D是微絲細(xì)胞骨架解聚劑，其作用機(jī)制是增加游離微絲的片段并阻止微絲重組[11]。加入細(xì)胞松弛素D后，細(xì)胞內(nèi)F-actin的重組受抑制，形成的應(yīng)力纖維明顯減少，同時(shí)熒光強(qiáng)度降低，說(shuō)明F-actin的量減少；與此同時(shí)，c-fos mRNA表達(dá)明顯降低。Knight等[8]指出：F-actin的重組很可能參與了應(yīng)力誘導(dǎo)c-fos基因的高表達(dá)。Pavalko等[2]發(fā)現(xiàn)：流體剪切力作用1 h后即能增加細(xì)胞中c-fos的表達(dá)，而導(dǎo)致這種現(xiàn)象產(chǎn)生的機(jī)制是應(yīng)力作用下細(xì)胞骨架的重組。有研究[12]指出：整合素、微絲細(xì)胞骨架、膜受體蛋白G蛋白能作用于力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制上述三方的任意之一均能抑制即刻早期基因的表達(dá)。張應(yīng)力作用下，F(xiàn)-actin的表達(dá)和重組受抑制的同時(shí)c-fos基因的表達(dá)也明顯降低，證實(shí)了F-actin重組是應(yīng)力誘導(dǎo)c-fos基因高表達(dá)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。

由本研究結(jié)果可見(jiàn)：在應(yīng)力加載作用下，F(xiàn)-actin微絲蛋白的量并沒(méi)有發(fā)生變化，只是出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)上的重組，而且重組的是既有的F-actin；F-actin重組是應(yīng)力誘導(dǎo)c-fos基因高表達(dá)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。

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