HPLC法測定大鼠血漿中奧拉西坦的濃度Δ

劉秀菊，張志清，楊秀嶺，杜杰，郭利（.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，石家莊050000；.河北邢臺市人民醫(yī)院，河北邢臺 05406）

奧拉西坦（Oxiracetam）化學(xué)名為4-羥基-2-酮-1-吡咯酰胺，是一種環(huán)γ-氨基丁酸（GABA）類促智藥，可促進(jìn)磷酰膽堿和磷酰乙醇胺的合成，提高大腦對氧和葡萄糖的利用及三磷酸腺苷/二磷酸腺苷的比值（ATP/ADP），使大腦中蛋白質(zhì)和核酸的合成增加；還能作用于谷氨酸鹽促代謝受體，防止谷氨酸所致的神經(jīng)毒性[1，2]。研究[3]顯示，奧拉西坦可改善記憶與智能障礙患者的記憶和學(xué)習(xí)功能。已報道的奧拉西坦血藥濃度測定方法，流動相制備復(fù)雜，血漿樣品處理操作煩瑣、成本高[4～8]。本研究擬建立大鼠血漿中奧拉西坦?jié)舛鹊母咝б合嗌V檢測方法，為奧拉西坦大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究提供方法學(xué)參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜系統(tǒng)，包括515泵、486紫外檢測器、Empower Application操作平臺（美國Waters公司）；GL-20G-Ⅱ冷凍離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；XW-80A渦旋混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；低溫冰箱（日本三洋公司）。

1.2 試藥

奧拉西坦對照品（石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)有限公司，批號:128101207，純度:99.60%）；奧拉西坦注射液（廣東世信藥業(yè)有限公司，批號:1012010，規(guī)格:1 g∶5 mL）；乙腈為色譜純。

1.3 動物

健康SD大鼠，清潔級，♂，體重（300±10）g，由河北省實驗動物中心提供，合格證號為SCXK（冀）2008-1-003。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Symmetry shiedTMRP18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相:乙腈-水（3.2∶96.8，V/V），流速:0.8 mL·min－1；檢測波長:210 nm ；柱溫:40 ℃；進(jìn)樣量:20 μL。

2.2 血漿樣品處理

取冷凍血漿樣品室溫自然解凍，5 000 r·min－1離心5 min，取上清液200 μL置于帶塞離心管中，加乙腈300 μL沉淀蛋白，渦旋振蕩1 min，10 000 r·min－1離心5 min，取上清液20 μL進(jìn)樣分析。

2.3 專屬性試驗

奧拉西坦對照品溶液直接進(jìn)樣，另取空白血漿、空白血漿+奧拉西坦對照品及給藥后2 h的血漿樣品分別按“2.2”項下處理并測定，記錄色譜。結(jié)果表明，在“2.1”項色譜條件下，奧拉西坦峰形良好，保留時間為3.65 min，大鼠血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對奧拉西坦的測定無干擾。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取奧拉西坦對照品約100 mg，置于100 mL量瓶中，蒸餾水定容制備成濃度為1 000 mg·L－1的奧拉西坦貯備液。分別精密量取奧拉西坦貯備液適量，制備成濃度為1 000、600、400、200、100、50、20 mg·L－1的奧拉西坦對照品溶液。取上述溶液各100 μL，分別置于3 mL帶塞離心管中，加入空白血漿900 μL，制成濃度為100、60、40、20、10、5、2 mg·L－1的模擬血漿樣品，按“2.2”項下處理并測定。以奧拉西坦峰面積（Y）對血漿藥物濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y＝13 044X－15 957（r＝0.999 8，n＝7），奧拉西坦檢測濃度的線性范圍為2～100 mg·L－1，最低檢出濃度為0.01 mg·L－1。

2.5 回收率試驗

取空白血漿15份，分為3組，每組5份，分別制備成低、中、高（5、20、60 mg·L－1）3種濃度的奧拉西坦模擬血漿樣品，按“2.2”項下處理并測定，以奧拉西坦峰面積與等量奧拉西坦對照品溶液直接進(jìn)樣的峰面積比，即為奧拉西坦的絕對回收率；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算藥物濃度，以測得藥物濃度與已知藥物濃度之比，計算方法回收率。結(jié)果，低、中、高濃度的模擬血漿樣品的絕對回收率分別為（91.1±5.17）%、（97.9±3.22）%、（98.4±1.99）%；方法回收率分別為（96.35±3.01）%、（101.40±3.41）%、（102.23±1.37）%。

2.6 精密度試驗

按“2.5”項下方法制備低、中、高3種濃度的奧拉西坦模擬血漿樣品，分別放置1、2、3、4、5 h，按“2.2”項下處理并測定。同日測定5次，計算日內(nèi)RSD；另每日測定1次，連續(xù)測定5 d，計算日間RSD。精密度試驗結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗結(jié)果（±s，n＝5）Tab 1 Results of precision tes（t±s，n＝5）

表1 精密度試驗結(jié)果（±s，n＝5）Tab 1 Results of precision tes（t±s，n＝5）

RSD/%3.25 3.17 3.14質(zhì)量濃度/mg·L－1 5 20 60日內(nèi)實測值/mg·L－1 4.88±0.14 19.41±0.85 57.74±2.04 RSD/%2.86 4.38 3.54日間實測值/mg·L－1 4.88±0.16 20.35±0.65 58.82±1.85

2.7 穩(wěn)定性試驗

取空白血漿，按“2.4”項下方法制備成濃度為20 mg·L－1的奧拉西坦模擬血漿樣品，照“2.2”項下處理，處理時間分為即刻處理、－40℃低溫保存30 d后處理、反復(fù)凍融3次后處理，然后進(jìn)樣測定，考察血漿樣品低溫保存穩(wěn)定性、反復(fù)凍融穩(wěn)定性；另即刻處理后，分別放置0、1、2、3、4 h后進(jìn)樣測定，考察血漿樣品處理后放置穩(wěn)定性。結(jié)果表明，奧拉西坦血漿樣品低溫保存穩(wěn)定性、反復(fù)凍融穩(wěn)定性均良好，血漿樣品處理后放置4 h穩(wěn)定性良好。

2.8 血漿樣品的測定

取奧拉西坦注射液1支（1 g∶5 mL），置于25 mL量瓶中，蒸餾水定容，制備成濃度為40 mg·mL－1的奧拉西坦溶液（臨用現(xiàn)配）。取大鼠8只，禁食不進(jìn)水12 h后，按人臨床常用劑量換算200 mg·kg－1的劑量一次性灌胃給予奧拉西坦溶液1.5 mL，分別于給藥前和給藥后2 h眼內(nèi)眥取血0.5 mL，置于肝素鈉抗凝的帶蓋塑料離心管中，3 000 r·min－1離心5 min，取上層血漿，－40℃冰箱保存待測。冷凍血漿樣品按“2.2”項下處理并測定。結(jié)果，8只大鼠血漿樣品中奧拉西坦?jié)舛确謩e為38.16、20.05、38.52、27.28、30.65、41.91、56.04、32.00 mg·L－1，平均濃度為（35.58±10.83）mg·L－1。

3 討論

奧拉西坦是一種極性很強的小分子物質(zhì)，水溶性很強，而在有機溶劑中的分配系數(shù)很小，很難用有機溶劑從生物樣品中提取分離出來供高效液相色譜分析[5，6]。本實驗采用耐水的Waters C18反相色譜柱，調(diào)整流動相的組成，增加流動性中極性成分的比例并降低流速，使待測物的保留時間維持在3.65 min，與血漿內(nèi)源性物質(zhì)分離完全。

本研究選擇檢測波長為210 nm，該波長下，大多數(shù)脂溶性高、極性較弱的藥物不易檢測，而對極性較大的奧拉西坦則較為適宜。進(jìn)行反相高效液相色譜分析時，最常采用甲醇作為流動相的主要成分，但其紫外截止波長為205 nm，與210 nm接近，故本實驗采用乙腈作為流動相[7]。

本研究結(jié)果顯示，本方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用于大鼠血漿中奧拉西坦?jié)舛鹊臏y定。

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