盧 敏 王帥豪 狄元冉 袁 林 尹清強

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002)

纖維素是自然界中最豐富的天然有機物，占植物界碳含量的50%以上，堪稱為世界上總量最大的可再生資源。地球每年都會產(chǎn)生大量的植物纖維素，我國僅農(nóng)作物秸稈年產(chǎn)量就高達6×108～7×108t，但這些寶貴的纖維素資源并沒有被有效地利用，只有少部分用于造紙、紡織或用作粗飼料、薪柴等，大部分以堆積、荒燒等形式直接傾入環(huán)境，造成極大的污染和浪費［1］。合理地開發(fā)與利用纖維素資源對人類生存環(huán)境和可持續(xù)發(fā)展有著舉足輕重的影響。

利用微生物及其產(chǎn)生的纖維素酶(cellulase)來分解纖維素是一種有效且無污染的方法。纖維素酶是降解纖維素的高活性生物催化劑，廣泛用于飼料、環(huán)保、食品、釀酒、紡織、造紙等領(lǐng)域，但纖維素酶的工業(yè)化生產(chǎn)受到酶效率低、熱穩(wěn)定性差以及成本較高等諸多因素的限制。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程手段開發(fā)高活性、高產(chǎn)量的纖維素酶資源越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的重視。目前，纖維素酶基因的克隆及表達已經(jīng)取得了很大的進展，本文旨在對纖維素酶基因工程研究的進展、發(fā)展前景進行簡要的綜述。

1 纖維素酶的組成

纖維素酶是將纖維素水解成纖維二糖和葡萄糖的一組復(fù)雜酶系的總稱，細菌、真菌、放線菌等微生物都能產(chǎn)纖維素酶。細菌纖維素酶不能分泌到胞外，而且產(chǎn)量少、酶系單一、活性低。真菌則能產(chǎn)生大量的胞外纖維素酶，酶系較完全，產(chǎn)纖維素酶的真菌來源十分廣泛，如木霉屬、曲霉屬和青霉屬等。其中木霉不產(chǎn)生毒素，而且產(chǎn)酶效率高、活性高、酶性穩(wěn)定，是目前應(yīng)用最廣的纖維素酶生產(chǎn)菌［2］。

纖維素酶并不是一種單一組分的酶，而是由許多高協(xié)同作用的水解酶組成的復(fù)合酶體系，根據(jù)其催化反應(yīng)功能的不同可分為:1)內(nèi)切葡聚糖酶［內(nèi)切 － 1，4-β-D － 葡聚糖酶(endo-1，4-β-D-glucanase)，EC 3.2.1.4］，來自真菌的簡稱為 EG，來自細菌的簡稱為Cen，又稱Cx、CMC;2)外切葡聚糖酶［外切 －1，4-β-D － 葡聚糖酶(exo-1，4-β-D-glucanase)，EC 3.2.1.91］，來自真菌的簡稱為CBH，來自細菌的簡稱為Cex，又稱C1、微晶纖維素酶;3)β－葡萄糖苷酶［β-1，4－葡萄糖苷酶(β-1，4-glucosidase)，EC 3.2.1.21，BG］，又稱纖維二糖酶。纖維素的完全水解，是這3種酶的協(xié)同作用，內(nèi)切葡聚糖酶隨機切割纖維素多糖鏈內(nèi)部的無定型區(qū)，產(chǎn)生不同長度的寡糖和新鏈的末端。外切葡聚糖酶作用于這些還原性和非還原性的纖維素多糖鏈的末端，釋放葡萄糖或纖維二糖。β－葡萄糖苷酶水解纖維二糖產(chǎn)生2分子的葡萄糖［3］。

2 纖維素酶的分子結(jié)構(gòu)

對纖維素酶分子結(jié)構(gòu)的認識開始于1986年，Tilbeurgh等［4］用木瓜蛋白酶對瑞氏木霉(Trichoderma reesei，又譯作里氏木霉)的CBHⅠ分子進行限制性酶切，得到2個具有獨立活性的結(jié)構(gòu)域:具有催化功能的催化域(catalytic domain，CD)和具有結(jié)合纖維素功能的纖維素結(jié)合域(cellulose binding domain，CBD)。之后用類似的方法在多種細菌和真菌的纖維素酶中發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)構(gòu)，CBD在纖維素酶中位于氨基端或羧基端，它通過1段高度糖基化的連接橋(linker)與CD相連。CBD使纖維素酶結(jié)合于纖維素表面，使得臨近的CD易于接近底物，促進底物的水解。Linder等［5］的研究表明，纖維素酶去除CBD后對可溶性底物活性影響較小，而對結(jié)晶纖維素的吸附和水解活性則有明顯降低。CBD的存在對于外切葡聚糖酶的識別底物及催化尤為重要［6］。只有少數(shù)微生物和高等植物產(chǎn)生的纖維素酶不具有這類結(jié)構(gòu)域，如厭氧性的熱纖梭菌(Clostridium themocellum)的纖維素酶［7］，是依靠纖維小體吸附于纖維底物上的。CD是纖維素酶的催化活性中心，纖維素內(nèi)切酶和外切酶的底物特異性可以由CD的三維結(jié)構(gòu)進行合理的解釋［8］:內(nèi)切酶的活性位點位于1個開放的裂口(cleft)中，它可結(jié)合于纖維素鏈的任何部位并切斷纖維素鏈;外切酶的活性位點位于1個環(huán)(loop)所形成的通道(tunnel)里面，它只能從纖維素鏈的非還原性末端切下纖維二糖。連橋是1段富含脯氨酸和羥脯氨酸的連接肽，它的作用可能是保持CD和CBD之間的距離，有助于同酶分子間形成較為穩(wěn)定的聚集體［9］。

3 纖維素酶基因的克隆

天然纖維素酶由于酶活較低以及生產(chǎn)成本較高等因素的限制，大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用有一定的困難，對纖維素酶基因進行克隆，構(gòu)建高效纖維素酶產(chǎn)生菌越來越受到人們的重視，同時也為纖維素酶的大規(guī)模生產(chǎn)提供了新的途徑。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，人們在纖維素酶基因克隆方面進行了卓有成效的研究。自1982年Whittle等［10］首次報道纖維單胞菌(Cellulomonas fimi)的纖維素酶基因被克隆以來，人們不斷從細菌與真菌中發(fā)現(xiàn)和分離出纖維素酶系，大量纖維素酶的基因得到克隆和表達，極大地豐富了纖維素酶的研究材料。目前已有數(shù)千種纖維素酶基因序列和相應(yīng)的氨基酸序列被公布在GenBank、歐洲分子生物學(xué)實驗室(EMBL)核苷序列數(shù)據(jù)庫、日本DNA數(shù)據(jù)庫(DDBJ)等共享數(shù)據(jù)庫中。由于木霉屬產(chǎn)纖維素酶有產(chǎn)酶效率高、酶系全、活性高、較為穩(wěn)定等諸多優(yōu)點，對木霉屬基因的研究最多，外切酶基因CBHⅠ、CBHⅡ，內(nèi)切酶基因 EGⅠ、EGⅡ、EGⅢ、EGⅣ、EGⅥ，葡萄糖苷酶基因BGⅠ、BGⅡ等都已經(jīng)被克隆，并且轉(zhuǎn)化至大腸桿菌進行了表達。祝令香等［11］克隆并測定了康寧木霉K801纖維素酶CB HⅠ基因序列，發(fā)現(xiàn)與瑞氏木霉已知序列的同源性達到99.89%。肖志壯等［12］利用PCR方法從瑞氏木霉cDNA文庫中擴增出全長內(nèi)切葡聚糖酶EGⅢ基因并克隆到釀酒酵母非整合型表達載體pAJ401上，轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中表達出具有活性的EGⅢ蛋白。石賢愛等［13］從長梗木霉中PCR擴增獲得BGLⅡ、CBHⅡ和EGⅠ基因，這3種纖維素酶基因與GenBank上其他木霉同種纖維素酶基因具有較高同源性，對上述纖維素酶基因編碼的相應(yīng)蛋白進行結(jié)構(gòu)序列檢索(PROSITE motif search)，對其N端糖基化位點、纖維素結(jié)合區(qū)、糖基水解酶家族特征結(jié)構(gòu)區(qū)等進行了定位。林玲等［14］擴增得到瑞氏木霉纖維素酶的編碼基因EGLⅡ，連接到 pET-28a載體上，轉(zhuǎn)化到 E.coli BL21(DE3)宿主菌中，并進行了蛋白表達的檢測。

4 纖維素酶基因的原核表達

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，幾乎所有已克隆的纖維素酶基因都在大腸桿菌中進行了表達。黃艷等［15］從康氏木霉中克隆得到纖維素酶EGⅠ基因，重組到T7啟動子控制下的表達載體pET-His中，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，十二烷基四乙酸二鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測到重組產(chǎn)物分子質(zhì)量約為45 ku，在大腸桿菌中成功表達，并對重組酶的粗酶液進行了酶學(xué)性質(zhì)的初步研究。王萬能［16］利用反轉(zhuǎn)錄PCR方法技術(shù)，從福壽螺中克隆纖維素酶基因 CelAg，并構(gòu)建于表達載體 pET-30a(+)上，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，重組菌發(fā)酵后測得纖維素酶活可達8.31 U/mL。任慧杰等［17］采用PCR技術(shù)克隆了松材線蟲纖維素酶的編碼基因BXC46，將其克隆到表達載體pET-15b上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，檢測到部分純化的重組蛋白具有纖維素酶的活性，其最適溫度為45℃，最適pH為4.0。

由于大腸桿菌的分泌表達水平很低，而且產(chǎn)生的纖維素酶大部分不能分泌到胞外，提取有很大的困難，無法達到纖維素酶生產(chǎn)的要求。為了得到胞外分泌物，一些纖維素酶基因已經(jīng)成功在枯草芽孢桿菌、乳酸發(fā)酵短桿菌和變青鏈霉菌等中得到了有效表達［18］。趙瑩等［19］成功地構(gòu)建了可以在乳酸菌與大腸桿菌之間穿梭表達的原核表達重組質(zhì)粒pW425t-CBHⅡ，將pW425t2-CBHⅡ轉(zhuǎn)化至大腸桿菌胸腺嘧啶合成酶(thyA)基因缺陷型的乳酸桿菌感受態(tài)細胞中，測得重組菌CBHⅡ的酶活達到0.115 6 U/mL，反應(yīng)最適溫度和pH分別為50℃和5.0。李方正［20］克隆了1株枯草芽孢桿菌EG基因序列，測得該基因序列全長1 518 bp，構(gòu)建重組乳球菌表達質(zhì)粒pMG36e-EG，電轉(zhuǎn)化至乳球菌MG1614感受態(tài)細胞，成功構(gòu)建了產(chǎn)內(nèi)切纖維素酶的基因工程乳酸菌。

5 纖維素酶基因的真核表達

5.1 纖維素酶基因在酵母中的表達

纖維素酶基因在異源宿主中的表達要遇到蛋白水解酶和糖基化等問題，這使得酵母菌成為表達的首選菌，它不僅可以對表達的蛋白進行翻譯后的加工和修飾，使表達出的蛋白具有生物活性，而且酵母本身分泌的蛋白成分很少，利于表達蛋白的分離純化，是目前較為理想的真核表達系統(tǒng);此外，酵母菌繁殖速度快、營養(yǎng)要求低、培養(yǎng)基價格低廉、便于工業(yè)化生產(chǎn)［21］。張煜等［22］采用畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統(tǒng)進行了瑞氏木霉CBHⅡ基因的表達。母敬郁等［23］從褐色熱單孢菌(Thermomonospora fusca)中PCR擴增纖維素酶Cel6A基因，克隆到表達載體pGAPZαA上，轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X-33并成功表達，用羧甲基纖維素法測得發(fā)酵上清液中酶活為500 U/mg，用濾紙法測得酶活為1 U/mg。王利英等［24］反轉(zhuǎn)錄得到葡聚糖內(nèi)切酶EGⅠ和EGⅢ基因的cDNA，將其克隆到酵母載體中，成功構(gòu)建了產(chǎn)生纖維素酶的釀酒酵母工程菌。劉海英等［25］將長梗木霉SSL的EGⅠ基因表達于畢赤酵母，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后，胞外重組EGⅠ的酶活達73 U/mL。田生禮等［26］應(yīng)用 PCR技術(shù)從嗜堿性芽孢桿菌ATCC21833中擴增堿性纖維素酶基因，克隆至酵母整合型表達載體pGAPZaA中，并轉(zhuǎn)化至巴氏畢赤酵母GS115，成功構(gòu)建了表達堿性纖維素酶的畢赤酵母工程菌。黃時海等［27］克隆了康氏木霉CBHⅠ基因，并在畢赤酵母中成功表達，表達產(chǎn)物酶活達到24.1 U/L。

纖維素的降解是纖維素酶系協(xié)同作用的結(jié)果，在酵母中表達多個纖維素酶，則可以得到直接降解纖維素的酵母工程菌。已有研究表明多個纖維素酶基因共轉(zhuǎn)化酵母，其表達產(chǎn)物酶活有一定的提高，而且對纖維素也具有更好的降解作用。丁新麗等［28］構(gòu)建了同時表達CBHⅠ和EGⅠ基因的重組酵母菌株，濾紙酶活比單獨表達EGⅠ基因的重組菌株提高14.3%。龔映雪等［29］從綠色木霉中獲得纖維素酶基因EGⅢ和CBHⅡ，以pScIKP為載體，將EGⅢ和CBHⅡ基因共轉(zhuǎn)化釀酒酵母，獲得重組酵母菌株S.cerevisiae-EC。該重組酵母能降解羧甲基纖維素形成水解圈，且2種酶具有協(xié)同作用，能更有效降解非結(jié)晶纖維素。

5.2 纖維素酶基因在真菌及植物中表達

絲狀真菌自身就是纖維素酶合成的重要菌種，同時也是優(yōu)良的外源基因表達系統(tǒng)，如瑞氏木霉外源基因表達系統(tǒng)中的CBHⅠ基因是強啟動子［30］，可以有效地表達外源基因。汪天虹等［31］采用PCR技術(shù)體外擴增獲得了瑞氏木霉CBHⅠ基因啟動子和終止子序列。并以大腸桿菌質(zhì)粒pUC19為骨架，在該啟動子和終止子序列間加入多克隆位點，構(gòu)建了瑞氏木霉強表達整合型載體pTRIL。石矛［32］將強啟動子 PKIα 與綠色木霉CBHⅡ基因序列連接，成功構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pUT-CE，并用電穿孔法轉(zhuǎn)化回原宿主菌綠色木霉，纖維素酶工程菌培養(yǎng)72 h，總酶活達到45 U/(mL·h)，Cx酶活達到1 600 U/(mL·h)，C1酶活達到160 U/(mL·d)，葡萄糖苷酶活達到15 U/(mL·h)。胡耀輝等［33］以瑞氏木霉 PcbhⅡ為啟動子，pCAMBIA1302為載體，成功構(gòu)建了CBHⅡ基因過量表達的綠色木霉工程菌。此外，楊培周等［34］構(gòu)建了毛柄金錢菌gpd啟動子驅(qū)動的福壽螺纖維素酶基因(mfc)的真核表達載體，并將基因整合入灰蓋鬼傘基因組中，得到的工程菌酶酶活最高達到:濾紙酶活21.5 U/mL、CMC酶活44 U/mL，分別是對照組的1.79 和 1.6 倍。

采用基因工程手段將編碼纖維素酶的基因?qū)胫参镏?，使植物大量合成纖維素酶，將纖維素轉(zhuǎn)化為單糖，這樣就能大大提高纖維素的消化率與吸收率［35］。另外，以作物為原料表達纖維素酶在生物乙醇生產(chǎn)中也具有極大的潛能，在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)生產(chǎn)纖維素酶比在微生物中要廉價的多，這是以植物為載體生產(chǎn)纖維素酶的最大優(yōu)勢［36］。呂明等［37］以 pAHC17、pCD29A 質(zhì)粒為基礎(chǔ)，分別構(gòu)建了Ubi啟動子調(diào)控的纖維素酶基因(BGLⅠ、CBHⅡ)與rd29A啟動子調(diào)控的DREB1A基因的雙價植物表達載體pBDB、pBDC，并將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到根癌農(nóng)桿菌 LBA4404中。胡一飛［36］利用PCR方法從瑞氏木霉克隆得到 EGⅤ、EGⅣ、CBHⅠ基因，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將EGⅤ基因轉(zhuǎn)化到水稻中，通過免疫印跡(Western blot)雜交檢測到轉(zhuǎn)基因株系的T0代干枯秸稈和T1代鮮活葉片中瑞氏木霉EGⅤ基因得到了表達，有一定的蛋白產(chǎn)物，并且在室溫儲藏了3個月的T0代秸稈中穩(wěn)定存在。蔣西然［38］利用褐色高溫單孢菌的耐高溫內(nèi)切纖維素酶(E2)和外切纖維素酶(E3)構(gòu)建了7種植物表達載體，實現(xiàn)了將外源纖維素酶在煙草細胞的質(zhì)外體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞質(zhì)基質(zhì)的定位表達。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將表達載體導(dǎo)入煙草，PCR檢測表明纖維素酶基因在煙草中成功轉(zhuǎn)錄。

6 小結(jié)

纖維素酶基因的克隆與表達已經(jīng)取得了很大的進展，但表達、分泌均較弱，并沒在真正意義上得到高效分解纖維素的工程菌，不能大規(guī)模的應(yīng)用于生產(chǎn)。纖維素酶基因酵母表達系統(tǒng)的構(gòu)建仍是研究的熱點，選擇性的將多個纖維素酶基因在酵母中共表達，是今后研究的一個重要方向。木霉具有十分成熟的批量發(fā)酵技術(shù)，還有較強的蛋白質(zhì)胞外分泌能力，隨著木霉表達系統(tǒng)的不斷成熟，纖維素酶基因在木霉中表達的研究將會越來越多?？傊ㄟ^對纖維素酶基因工程的研究，纖維素酶應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的進程也在加快，相信隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，纖維素酶基因工程的研究也會不斷地完善，更多的纖維素酶基因?qū)⒈豢寺〖氨磉_，纖維素酶基因工程菌將會真正的應(yīng)用于生產(chǎn)。

［1］ LYND L R，PAUL J W，VAN ZYL W H，et al.Microbial cellulose utilization:fundamentals and biotechnology［J］.Microbiology and Molecular Biology Reviews，2002，66(33):506 －577.

［2］ 高鳳菊，李春香.真菌與細菌纖維素酶研究進展［J］.唐山師范學(xué)院學(xué)報，2005，27(2):7 －10.

［3］ 張杰，張曉東，孟祥梅，等.纖維素酶研究進展［J］.可再生能源，2007，25:57 －60.

［4］ TILBEURGH H，TOMME P，CLAEYSSENS M，et al.Limited proteolysis of the cellobiohydrolase Ⅰfrom T.reesei［J］.FEBS Letters，1986，204(2):223－227.

［5］ LINDER M，LINDEBERG G，REINIKAINEN T，et al.The difference in affinity between two fungal cellulose-binding domains is dominated by a single amino acid substitution［J］.FEBS Letters，1995，372(1):96－98.

［6］ TEERI T T，KOIVULA A，LINDER M，et al.Trichoderma reesei cellobiohydrolases:why so efficient on crystalline cellulose?［J］.Biochemical Society Transactions，1998，26:173 －178.

［7］ 高培基，曲音波，汪天虹，等.微生物降解纖維素機制的分子生物學(xué)研究進展［J］.纖維素科學(xué)與技術(shù)，1995，3(2):1 －19.

［8］ MEINKE A，BHAT S.Cellulose degrading enzymes and their potential industrial application［J］.Biotechnology Advances，1997，15:583 －620.

［9］ 閻們旭，齊飛，張穎舒.纖維素酶分子結(jié)構(gòu)和功能研究進展［J］.生物化學(xué)與生物物理進展，1999，26(3):235－237.

［10］ WHITTLE D J，KILBURN D G，WARREN R A J，et al.Molecular cloning of a Cellulomonas fimi cellulase gene in Escherichia coli［J］.Gene，1982，17(2):139－145.

［11］ 祝令香，于巍.康寧木霉K801纖維素酶CBHⅡ基因的克隆及序列分析［J］.菌物系統(tǒng)，2001，20(2):174－177.

［12］ 肖志壯，王婷，汪天虹.瑞氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶EGⅢ基因的克隆及在釀酒酵母中的表達［J］.微生物學(xué)報，2001，41(4):391 －396.

［13］ 石賢愛，劉月，陳飛，等.長梗木霉纖維素酶基因的克隆及序列分析［J］.微生物學(xué)通報，2010，37(5):671－676.

［14］ 林玲，林志偉，郭梧年.木質(zhì)素降解菌的篩選及其纖維素酶基因克隆表達研究［J］.中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，17(5):938 －943.

［15］ 黃艷，凌敏，覃擁靈，等.康氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶(EGⅠ)基因的克隆及表達［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，18(2):10 －13.

［16］ 王萬能.福壽螺纖維素酶基因的原核表達［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(19):8914 －8915.

［17］ 任慧杰，郭道森，趙博光.松材線蟲纖維素酶基因的克隆及在大腸桿菌中的表達［J］.青島大學(xué)學(xué)報:工程技術(shù)版，2011，26(1):63 －69.

［18］ 馬翠鸞，何玉財，咸漠.分子生物學(xué)技術(shù)在纖維素酶改造中的應(yīng)用［J］.化工科技，2008，16(5):52－57.

［19］ 趙瑩，孫哲，劉燕，等.酸性纖維素酶CBHⅡ基因與非抗性穿梭表達載體的重組及在乳酸桿菌的表達及其活性檢測［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2009，40(5):670－675.

［20］ 李方正.纖維素降解菌的分離、鑒定及產(chǎn)內(nèi)切纖維素酶基因工程乳酸菌的構(gòu)建［D］.碩士學(xué)位論文.泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

［21］ 劉忠淵，張春，毛新芳，等.利用畢赤酵母表達外源蛋白的研究［J］.生物技術(shù)，2004，14(1):56 －58.

［22］ 張煜，劉剛，邢苗，等.里氏木霉纖維二糖水解酶Ⅱ在畢赤酵母中的高效表達［J］.菌物學(xué)報，2005，24(3):367－375.

［23］ 母敬郁，王曦，王嶠，等.重組Thermomonospora fusca纖維素酶Cel6A在畢赤酵母中的表達及純化［J］.中國生物制品學(xué)雜志，2006，19(6):578 －582.

［24］ 王利英，劉一，楊登峰，等.綠色木霉葡聚糖內(nèi)切酶cDNA基因的克隆及其在釀酒酵母中的表達［J］.廣西科學(xué)，2007，14(3):315 －319.

［25］ 劉海英，王娟，舒正玉，等.長梗木霉內(nèi)切葡聚糖酶Ⅰ基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達［J］.微生物學(xué)通報，2009，36(3):355 －359.

［26］ 田生禮，邵睿，劉剛，等.堿性纖維素酶基因在巴氏畢赤酵母中的表達及重組酵母菌發(fā)酵工藝的優(yōu)化［J］.中國生物制品學(xué)雜志，2009，22(5):425 －437.

［27］ 黃時海，李湘萍，康超，等.康氏木霉纖維素酶CBHⅠ基因克隆及在畢赤酵母中的表達研究［J］.釀酒科技，2011(1):24－27.

［28］ 丁新麗，汪天虹，張光濤.瑞氏木霉纖維素酶基因在釀酒酵母中的表達研究［J］.釀酒科技，2005(9):28－35.

［29］ 龔映雪，臺艷，肖文娟.酵母多基因表達載體在纖維素生物轉(zhuǎn)化中應(yīng)用［J］.深圳大學(xué)學(xué)報:理工版，2010，27(1):82 －86.

［30］ 吳靜，汪天虹.絲狀真菌瑞氏木霉生產(chǎn)重組蛋白的分子生物學(xué)研究進展［J］.生物工程進展，1999，19(2):8－12.

［31］ 汪天虹，吳志紅.絲狀真菌瑞氏木霉外源基因表達系統(tǒng)的構(gòu)建［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2003，12:736 －742.

［32］ 石矛.纖維素酶工程菌的構(gòu)建及表達［D］.碩士學(xué)位論文.長春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［33］ 胡耀輝，閆舟，于寒松.高產(chǎn)纖維素酶綠色木霉基因工程菌的構(gòu)建［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(25):13617－13619.

［34］ 楊培周，郭麗瓊，林俊芳.毛柄金錢菌gpd啟動子驅(qū)動福壽螺纖維素酶基因在灰蓋鬼傘菌中的表達［J］.食品科學(xué)，2011，15:209 －213.

［35］ HILDEN L，GUNNAR J.Recent developments on cellulases and carbohydrate-binding modules with cellulose affinity［J］.Biotechnology Letters，2004，26:1683－1693.

［36］ 胡一飛.里氏木霉纖維素酶基因的克隆及在水稻中的過表達研究［D］.碩士學(xué)位論文.合肥:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［37］ 呂明，李杰，柏錫，等.纖維素酶基因(BGLⅠ、CBHⅡ)與DREB1A基因雙價植物表達載體的構(gòu)建［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，38(5):619 －623.

［38］ 蔣西然.耐高溫纖維素酶在煙草中的表達［D］.碩士學(xué)位論文.大連:大連理工大學(xué)，2011.