劉自安 徐戰(zhàn)鋒
酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)是目前血站實驗室最常用的免疫學(xué)檢測方法,由于其試劑穩(wěn)定,易保存,操作簡便,結(jié)果判斷較為客觀[1],既適宜于大量血液篩查,又可用于少量標(biāo)本的檢測。ELISA試驗以其靈敏度較高、特異性較強,重復(fù)性較好等特點在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用,但影響試驗檢測效果的因素也較多,現(xiàn)就本人在實驗操作過程中常見的影響因素進(jìn)行分析與描述,以提高ELISA檢測質(zhì)量和水平。
顯色步驟結(jié)束后,酶標(biāo)反應(yīng)板所有孔均無顏色。
1.2.1 實驗結(jié)束后,包括陽性對照、室內(nèi)質(zhì)控在內(nèi)的所有板孔顏色均較淡。
1.2.2 實驗結(jié)束后,陰陽性對照正常,室內(nèi)質(zhì)控正常,但血液標(biāo)本感覺顯色較弱。
1.2.3 實驗結(jié)束后,陰陽性對照正常,但室內(nèi)質(zhì)控品或個別弱陽性標(biāo)本未能檢出。
1.2.4 終止完成后,目測結(jié)果正常,但酶標(biāo)儀讀值偏低,甚至出現(xiàn)多孔負(fù)值。
1.3.1 終止完成后,整板結(jié)果呈現(xiàn)均一的淡黃色或陰陽性對照、質(zhì)控均正常,但陰性標(biāo)本OD值過高。
1.3.2 出現(xiàn)隨機性的花板及跳孔現(xiàn)象。
假陽性現(xiàn)象是一個綜合現(xiàn)象,可參考上述1.3 中的分析與描述。
2.1.1 試劑已過效期,或不同試劑盒組分混用。
2.1.2 錯加、漏加試劑組分。
2.1.3 洗板及加樣過程中,酶結(jié)合物受污染失活而失去催化顯色劑顯色的能力導(dǎo)致。
2.2.1 接近或超過有效期的試劑可能會產(chǎn)生很弱的信號。
2.2.2 試劑組分用前未平衡至室溫。
2.2.3 加入試劑的量和順序有誤。
2.2.4 洗板及加樣過程中,酶標(biāo)受污染失活而失去催化顯色劑顯色的能力導(dǎo)致?;蛘唢@色液受到污染。
2.2.5 孵育時間及孵育溫度未達(dá)到規(guī)定要求。
2.2.6 洗板次數(shù)過多,或濃縮洗液稀釋倍數(shù)不符合要求,或者用其他廠家洗液洗板,導(dǎo)致靈敏度偏低。
2.2.7 未達(dá)到要求的孵育溫度及孵育時間可檢出強陽性標(biāo)本,但弱陽性標(biāo)本受溫度變化影響較大而被未檢出。
2.2.8 室內(nèi)質(zhì)控品高溫放置過久或被反復(fù)凍融,致使待測物滴度下降,而未能檢出。
2.2.9 酶標(biāo)儀參數(shù)設(shè)置不正確或濾光片不匹配。
2.3.1 整板出現(xiàn)“黃板”現(xiàn)象
2.3.1.1 錯加其他試劑造成或盛放顯色劑容器受到污染。
2.3.1.2 顯色劑在光照條件下放置過久,實驗前已變藍(lán)。
2.3.1.3 孵育溫度過高或孵育時間過長。
2.3.1.4 未按要求洗板,如用自來水沖洗或者非本公司洗液洗板,特別是洗滌時每孔未注滿洗液,易造成花板黃板現(xiàn)象。
2.3.2 酶標(biāo)板呈現(xiàn)“花板”現(xiàn)象
2.3.2.1 血液標(biāo)本的采集、處理和保存方法不當(dāng)造成。
2.3.2.2 加樣時造成的交叉污染、手工洗板造成的交叉污染、手工拍板時造成的交叉污染以及洗板機某幾個加液頭堵塞等均可導(dǎo)致“花板”出現(xiàn)。
2.4.1 計算Cutoff 值時使用的公式不正確,導(dǎo)致計算得出的Cutoff值過低,從而導(dǎo)致假陽性出現(xiàn)。
2.4.2 洗板時板孔未能注滿洗液或洗板次數(shù)、浸泡時間不夠,未用試劑盒提供的洗液洗板,導(dǎo)致花板、跳孔,以致假陽性增多。
2.4.3 血液標(biāo)本處理不當(dāng),如標(biāo)本離心不徹底未完全除去細(xì)胞成分、纖維蛋白原及其它干擾物等,可出現(xiàn)孔底由點變藍(lán)的跳孔現(xiàn)象,此標(biāo)本重復(fù)實驗結(jié)果往往呈陰性反應(yīng)。
2.4.4 廠家試劑本身的質(zhì)量變化造成的假陽性。
3.1.1 每次實驗前應(yīng)檢查試劑各組分及批號,確認(rèn)試劑未過期。不同試劑盒或不同批號的試劑不能混用。
3.1.2 嚴(yán)格按試劑說明書進(jìn)行規(guī)范操作,錯加或漏加試劑組分將會出現(xiàn)白板的異常結(jié)果。加完試劑后可目視一下液面高度是否一致,以避免漏加現(xiàn)象。
3.1.3 疊氮鈉等酶抑制物會使酶標(biāo)記物失活,應(yīng)確認(rèn)盛酶標(biāo)的容器不含酶抑制劑,確認(rèn)配制洗液的容器已洗干凈,確認(rèn)配制洗液用的純化水達(dá)到要求且未受到污染。
3.2.1 實驗前檢查試劑的組分及批號,確認(rèn)試劑未過期。
3.2.2 從低溫冰箱中取出的試劑及樣品應(yīng)置室溫平衡30min。
3.2.3 確定所使用的每一種試劑加樣量準(zhǔn)確,且加入順序適當(dāng)。
3.2.4 酶免實驗中的標(biāo)本禁用疊氮鈉作為防腐劑,可選用proclin、硫柳汞等其他防腐劑。
3.2.5 孵育溫度和時間應(yīng)滿足試劑使用說明書規(guī)定的要求。
3.2.6 嚴(yán)格按說明書要求稀釋濃縮洗液及洗板,如濃縮洗液稀釋倍數(shù)、洗滌次數(shù)、浸泡時間等。必須用試劑廠家提供的洗液進(jìn)行洗板。
3.2.7 標(biāo)本若需在一周內(nèi)進(jìn)行檢測的,可暫存于2~8℃,如需長期保存,應(yīng)置于-20℃以下保存。室內(nèi)質(zhì)控品應(yīng)置于-20℃以下保存,避免反復(fù)凍融。
3.2.8 檢查儀器是否設(shè)定正確,特別是檢查濾光片是否匹配。必要時重新設(shè)定酶標(biāo)儀的參數(shù),如有懷疑,可重做實驗。
3.3.1 實驗前檢查試劑的組分及批號,確認(rèn)所有組分均屬于對應(yīng)的試劑盒。不同試劑盒或不同批號的試劑不能混用。
3.3.2 避免試劑組分間的交叉污染,確保吸頭、容器干燥潔凈。
3.3.3 顯色劑A和B未使用前應(yīng)避光保存。
3.3.4 孵育溫度和時間應(yīng)滿足試劑說明書規(guī)定的要求。
3.3.5 嚴(yán)格按試劑說明書要求洗板。洗滌時每孔均注滿洗液,洗滌次數(shù),每次浸泡時間應(yīng)嚴(yán)格掌握。
3.3.6 待檢標(biāo)本的處理方法:室溫下自然放置1~2h再用3000r/min離心15min備用[2]。
3.3.7 加標(biāo)本時應(yīng)避免交叉污染。如盛標(biāo)本的試管周圍常有血痂,易脫落,應(yīng)遠(yuǎn)離酶標(biāo)板。
3.3.8 手工洗板時第一次注洗液后應(yīng)立即棄去,后幾次再設(shè)定浸泡時間,可減少交叉污染。
3.3.9 確保加液頭疏通,洗板時每孔均應(yīng)注滿洗液,洗板完畢拍板時應(yīng)選用合適的吸水紙巾,不可把無關(guān)物質(zhì)拍進(jìn)板孔,并盡量不要在同位置拍打,以免交叉污染。
3.4.1 Cutoff值計算公式應(yīng)嚴(yán)格參照試劑說明書設(shè)置(不同廠家的Cutoff值計算公式不盡相同)。
3.4.2 嚴(yán)格按說明書要求洗板(不同廠家的試劑洗滌次數(shù)、浸泡時間不盡相同)。調(diào)整洗板機時,應(yīng)注意有時儀器標(biāo)示的液量與實際液量并不相符,應(yīng)根據(jù)實際情況調(diào)整至每孔注滿。
3.4.3 待檢測標(biāo)本應(yīng)放置4℃冰箱保存或新鮮標(biāo)本及時檢測[3]。
3.4.4 當(dāng)國家標(biāo)準(zhǔn)要求提高靈敏度時,廠家試劑的靈敏度也相應(yīng)提高,假陽率常常有所上升,但只要在合理范圍,是可以接受的。
全自動酶免分析儀在血站實驗室的普及,極大地促進(jìn)了酶免疫測定技術(shù)的臨床應(yīng)用,實現(xiàn)了ELISA檢測的標(biāo)準(zhǔn)化、減輕了實驗室技術(shù)人員的勞動強度,提高了臨床免疫測定的質(zhì)量和水平[4]。無論怎樣先進(jìn)的儀器都離不開人的操作,再先進(jìn)儀器也不能解決工作中出現(xiàn)的一切問題,ELISA檢測結(jié)果的正確與否對血站來說至關(guān)重要,一方面,假陽性結(jié)果會浪費寶貴的血液資源,另一方面,假陰性結(jié)果則不能確保臨床用血的安全。因此我們在實際操作中只有正確掌握影響ELISA試驗檢測效果的各類因素及其解決辦法,才能更好地操作儀器,提高血液檢測質(zhì)量,確保臨床用血安全。
[1]李楚潮.ELISA,RPR、Trust、TPPA四種方法檢測梅毒螺旋體抗體的結(jié)果分析[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2010,16(20):9-10.
[2]中國疾病預(yù)防控制中心.全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范[S].2004,08:1.
[3]石凌波,崔偉歷,張鳳川.檢驗醫(yī)學(xué)分析前質(zhì)量控制[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2009,08:246
[4]李金明主編.臨床酶免疫測定技術(shù)學(xué)[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2005,05:148