極大螺旋藻的硒富集化培養(yǎng)研究

楊瑩瑩，管 斌,*，孔 青，游 泳，高艷艷，張睿欽，李 肖，左 濤，劉進(jìn)昌，侯慶云

(1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2. 煙臺欣和企業(yè)食品有限公司研發(fā)中心，山東 煙臺 264006)

極大螺旋藻的硒富集化培養(yǎng)研究

楊瑩瑩1，管 斌1,*，孔 青1，游 泳1，高艷艷1，張睿欽1，李 肖1，左 濤1，劉進(jìn)昌2，侯慶云2

(1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2. 煙臺欣和企業(yè)食品有限公司研發(fā)中心，山東 煙臺 264006)

為得到大量含有機(jī)硒的極大螺旋藻(Spirulina maχima)，以生物量和藻體內(nèi)硒富集量作為指標(biāo)，研究不同硒添加量和硒添加方式對極大螺旋藻生長及富硒效果的影響。結(jié)果表明，分8d等量(100μL)多次添加100μg/mL Na2SeO3溶液，是最佳添加量和添加方式，可得到生物量為0.903g/L，單位干藻粉有機(jī)硒含量為1413.168μg/g的富硒極大螺旋藻。

極大螺旋藻；硒添加量；硒添加方式；生物量；有機(jī)硒含量

硒(selenium，Se)是人體必需的微量元素，構(gòu)成若干抗氧化酶的活性中心，可影響機(jī)體抗氧化能力和對相關(guān)疾病的抵抗能力，具有重要的生理功能和廣泛的藥理作用[1]。而螺旋藻(Spirulina)中含有極為豐富的營養(yǎng)成分和多種生物活性物質(zhì)，硒與螺旋藻結(jié)合產(chǎn)生富硒螺旋藻。富硒螺旋藻在醫(yī)藥和營養(yǎng)保健品開發(fā)方面已顯示出了應(yīng)用價值[2-4]。在培養(yǎng)液中添加亞硒酸鈉可以實現(xiàn)螺旋藻對硒的富集和有機(jī)化，而且螺旋藻對無機(jī)硒有較強的耐受性，工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)比較成熟，是對硒進(jìn)行生物有機(jī)化的理想載體[5-6]。本實驗通過無機(jī)硒不同添加量和添加方式，研究其對極大螺旋藻生長以及對硒生物富集效果的影響，以期獲得大量的富含有機(jī)硒的極大螺旋藻，為后期提取更多含硒藻膽蛋白等創(chuàng)造條件。

1 材料與方法

1.1 藻種與試劑

極大螺旋藻(Spirulina maχima)為中國海洋大學(xué)生物工藝實驗室保存藻種。

硒儲備液：1號儲備液：含10mg/mL Se(Ⅳ)的Na2SeO3溶液；2號儲備液：含100mg/mL Se(Ⅳ)的Na2SeO3溶液。亞硒酸鈉、碳酸氫鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-VIS 2802PC型紫外-可見分光光度計 尤尼柯)上海)儀器有限公司；722N型可見分光光度計 上海精密實驗設(shè)備有限公司；QHX-250BS-Ⅲ人工氣候箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.3培養(yǎng)條件與方法

在250mL三角瓶中加入100mL 優(yōu)化Zarrouk培養(yǎng)基[7]，用培養(yǎng)6d的螺旋藻(OD560nm約為0.6)作為藻種，接種量10%，在溫度30℃，初始pH值為9.3，光照度3500lx，光照時間24h/d條件下通氣培養(yǎng)，每天定時搖動3次。其中培養(yǎng)條件是根據(jù)前期所做的極大螺旋藻培養(yǎng)條件優(yōu)化實驗所得[7-8]。

1.4 硒的添加方法

1.4.1 不同添加量

為使極大螺旋藻能適應(yīng)含硒環(huán)境，需接種后在無硒環(huán)境中生長1d，積累一定的生物量后，自第2天起，連續(xù)8d在每天的同一時間，于培養(yǎng)瓶中加入2號硒儲備液，采用等量添加方式，使硒總加入量分別達(dá)200、400、600、800、1000、1200、1400、1600μg/mL。每個濃度設(shè)2個平行，以不添加硒的螺旋藻作空白對照，培養(yǎng)至10d后收集藻體。培養(yǎng)方法同1.3節(jié)，每隔1d，測量560nm處的OD值，繪制生長曲線。收集的藻體用于測定生物量和藻內(nèi)硒含量。具體添加方法如表1。

表1 等量添加方式下8d內(nèi)每天加硒量Table1 Selenium addition at the equal daily amounts for 8 consecutive days

1.4.2 不同添加方式

在總加硒量為800μg/mL基礎(chǔ)上，設(shè)計5種硒添加方式，每種添加方式設(shè)兩個平行。同1.4.1節(jié)，各種方式均需在無硒環(huán)境中生長至少1d，即最早第2天開始添加硒。第9天所有方式均添加完畢，繼續(xù)培養(yǎng)1d，待硒轉(zhuǎn)化吸收。共培養(yǎng)1 0 d，收集藻體。培養(yǎng)方法同1.3節(jié)，每隔1d，測定波長560nm處的OD值，繪制生長曲線。收集的藻體用于測定生物量和藻內(nèi)硒含量。添加方式如表2所示。

表2 硒添加方式Table2 Selenium addition modes

1.5 極大螺旋藻藻體收集和生物量測定

采用離心法。極大螺旋藻培養(yǎng)至第10天，測定藻液體積。倒入質(zhì)量恒定的離心管中，5000r/min離心15min，棄去上清液，藻絲體用蒸餾水洗滌，5000r/min離心15min，如法清洗3次。將獲得的藻體置80℃真空干燥箱干燥至質(zhì)量恒定，記錄數(shù)據(jù)，經(jīng)計算即可得生物量。所得干藻粉于4℃冰箱保存，待用。

1.6 硒含量的測定

采用催化硒光度法[9]測定極大螺旋藻中的硒含量。

1.6.1 硒含量標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別吸取含硒0.4μg/mL的亞硒酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL于比色管中，加入0.02mol/L EDTA溶液0. 8mL、0.2mol/L HCl-KCl緩沖液4mL、0.6mol/L KClO3溶液4mL、0.03mol/L 1,8-二羥基萘-3,6-二磺酸4mL、0.03mol/L鹽酸苯肼2mL，加水至25mL，搖勻，在沸水浴中加熱20min，于冷水中冷卻幾分鐘后，用紫外-可見分光光度計于520nm波長處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.2 極大螺旋藻硒含量測定

1)測總硒：稱取干藻粉0.02g于錐形瓶中，加入混合酸(濃硝酸、高氯酸體積比4:1)15～20mL，加熱至發(fā)煙，待溶液變?yōu)榈S色后，再加熱2～3min，此時溶液變?yōu)闊o色，冷卻后定容至100mL，待用。2)測無機(jī)硒：取0.02g干藻粉于100mL蒸餾水中，小火微沸30min，過濾得到濾液，定容至100mL，待用。

取適量所得樣品液于比色管中，加入各種試劑，具體步驟同1.6.1節(jié)，測520nm處吸光度，通過對照硒含量標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求得富硒螺旋藻中的總硒、無機(jī)硒含量?？偽繙p去無機(jī)硒含量得有機(jī)硒含量。定義有機(jī)硒比率為有機(jī)硒含量與總硒含量的比值，即：

2 結(jié)果與分析

2.1 硒添加量對極大螺旋藻生長的影響

當(dāng)硒質(zhì)量濃度低于400μg/mL時，能明顯促進(jìn)極大螺旋藻的生長，在生長前期(前5d)400μg/mL硒的促進(jìn)作用大于200μg/mL，5d后200μg/mL硒更有利于極大螺旋藻的生長(圖1)。當(dāng)硒添加質(zhì)量濃度為200μg/mL時，獲得最大生物量0.678g/L(圖2)。在較低的質(zhì)量濃度條件下，硒在細(xì)胞內(nèi)參與谷胱甘肽過氧化物酶的合成，它在超氧化物歧化酶的協(xié)助下，可有效地清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧自由基，延緩衰老，促進(jìn)藻細(xì)胞的生長[10]。當(dāng)添加量800、1000μg/mL硒時，前期促進(jìn)了極大螺旋藻生長，而后期抑制作用明顯(圖1)。出現(xiàn)這種情況的原因為：因分多天等量加硒，前期時，培養(yǎng)液中硒含量較低，分別為其添加總量的1/2左右(即第5天時積累量分別為100、200、300、400、500、600、700、800μg/mL)，隨著培養(yǎng)液中硒含量的不斷增加，硒對極大螺旋藻的促進(jìn)作用變?nèi)?，抑制作用變強。實際上，當(dāng)培養(yǎng)液中硒含量≥300μg/mL時(即總添加量為600μg/mL的第5天)，已開始抑制極大螺旋藻的生長。同時也可以看出，分8d添加硒含量400μg/mL，最終生物量高于未添硒的對照組(圖2)；而4d即添加400μg/mL硒(總添加量為800μg/mL的第5天)時已開始對極大螺旋藻產(chǎn)生強烈抑制作用(圖1)，使生長速率迅速下降。

圖1 不同硒質(zhì)量濃度條件下極大螺旋藻的生長曲線Fig.1 Growth curve of S. maχima under the environment with various selenium concentrations

圖2 硒添加量對螺旋藻生物量的影響Fig.2 Effect of selenium addition amount on the biomass of S. maχima

更高的硒質(zhì)量濃度(≥1200μg/mL)將導(dǎo)致極大螺旋藻的生物量及生長速率明顯下降，這可能與高硒對藻的毒性有關(guān)[11]。特別地，當(dāng)硒質(zhì)量濃度高達(dá)1400μg/mL以上時，將導(dǎo)致極大螺旋藻的過早死亡。

本實驗中，多次等量添加硒，總硒添加量≤400μg/mL時，可促進(jìn)極大螺旋藻生長，而在周志剛等[12]的研究中得出結(jié)論：超過60mg/L硒對其藻種產(chǎn)生抑制作用；400mg/L是其藻忍受的最大極限，即致死閾值。該實驗是以一次性加硒作為實驗基礎(chǔ)的，故對螺旋藻的抑制作用明顯。其次，雖然實驗都采用極大螺旋藻，但各實驗室的極大螺旋藻因長期培養(yǎng)、保藏的差異，其生理生化性能也會略有差異，故對硒的耐受性也會不同。從圖1可以看出，總硒添加量為1600μg/mL，第2天開始一次性添加了200μg/mL硒，在第2～3天的生長期內(nèi)，并沒有對極大螺旋藻產(chǎn)生明顯抑制作用。楊芳等[13]的研究，以一次性加硒為實驗基礎(chǔ)，當(dāng)硒質(zhì)量濃度高于1000mg/L時，(極大)螺旋藻的生長完全被抑制甚至死亡；當(dāng)質(zhì)量濃度大于320mg/L時對螺旋藻的生長產(chǎn)生明顯抑制，同樣驗證不同極大螺旋藻對硒的耐受程度不同。

楊芳等[14]的另一項研究在極大螺旋藻生長的第5天開始一次性加硒400μg/mL，添加總量最高達(dá)1000μg/mL，但對極大螺旋藻的生長抑制作用不是很強，最終生物量仍達(dá)0.9g/L以上。余景[5]在極大螺旋藻生長過程中分7d添加硒質(zhì)量濃度1000μg/mL，對其生長幾乎無影響或有弱的影響，已將高質(zhì)量濃度硒對螺旋藻生長的抑制作用大幅度降低。這些結(jié)果與本實驗數(shù)據(jù)是有一致性的，同時說明通過對極大螺旋藻藻種和硒添加方式的改進(jìn)，可以得到較高產(chǎn)量的富硒極大螺旋藻。

研究表明：分多次等量添加硒，硒添加量≤400μg/mL時，可促進(jìn)極大螺旋藻生長，且前5d高質(zhì)量濃度硒促進(jìn)作用較好，后期低質(zhì)量濃度硒促進(jìn)作用加強；添加硒質(zhì)量濃度為800～1000μg/mL時，前期促進(jìn)生長，后期嚴(yán)重抑制生長，且質(zhì)量濃度愈高，抑制作用愈明顯。硒質(zhì)量濃度≥1200μg/mL時，在藻生長期一直起抑制作用。

2.2 硒添加量對極大螺旋藻富硒效果的影響

表3 硒添加量對極大螺旋藻富硒的影響Table3 Effect of selenium addition amount on the enrichment of selenium in S. maχima

從表3可以看出，當(dāng)加硒量為800μg/mL時，單位干藻粉有最高有機(jī)硒含量，達(dá)971.836μg/g，有機(jī)硒比率也達(dá)到最高97.44%。硒質(zhì)量濃度＞800μg/mL時，隨著培養(yǎng)基中硒質(zhì)量濃度的增加，極大螺旋藻中的總硒含量和有機(jī)硒比率逐漸降低，說明極大螺旋藻對硒的富集和轉(zhuǎn)化具有一定的限度，可能原因為硒的毒性引起藻體對硒的排斥[15]。硒添加量為200μg/mL時，生物量為0.678g/L，有機(jī)硒含量為178.711μg/g，培養(yǎng)液中含有機(jī)硒量為121.17μg/L；加硒量為800μg/mL時，生物量為0.447g/L，有機(jī)硒含量為971.8μg/g，培養(yǎng)液中含有機(jī)硒量為434.39μg/L，是前者的3.6倍。因此，添加800μg/mL的硒，雖抑制了極大螺旋藻的生長，但為得到較多的有機(jī)硒和質(zhì)量好的富硒極大螺旋藻，仍選擇此條件作為下一步實驗的基礎(chǔ)。

2.3 硒添加方式對極大螺旋藻生長的影響

圖3 不同硒添加方式下極大螺旋藻的生長曲線Fig.3 Growth curve of S. maχima under the condition with different selenium addition modes

從圖3可看出，在極大螺旋藻生長初期一次性添加硒(實驗組1)會導(dǎo)致藻體死亡，這與鄭文杰等[16]研究中所述一次性加硒質(zhì)量濃度≥800mg/L時，極大螺旋藻會嚴(yán)重中毒死亡，結(jié)果一致。而在中間分3次添加(實驗組2)，因一次硒添加量≥250μg/mL，會對螺旋藻產(chǎn)生強烈抑制，添加完后，第8天部分藻體已開始死亡。這與陳填烽等[17]的研究結(jié)果出現(xiàn)較大差異。原因主要是因為藻種的不同，鈍頂螺旋藻一般比極大螺旋藻耐硒程度大[14]，在0.02～411.00mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)硒對(鈍頂)螺旋藻生長有促進(jìn)作用[18]，有的在552μg/mL條件下仍能正常生長[19]。而極大螺旋藻的一次性添加耐受硒質(zhì)量濃度低于400μg/mL[12]，故不適合短時間內(nèi)大量加入硒。

圖4 硒添加方式對極大螺旋藻生長量的影響Fig.4 Effect of selenium addition mode on the biomass of S. maχima

從圖4可以看出，分多次添加比一次性添加和中間加硒有利于極大螺旋藻的生長，等梯度加硒(實驗組4)得到最高生物量1.11g/L，結(jié)合等量加硒(實驗組3)和前后段等量加硒(實驗組5)分析，實驗組4前期加硒量較少，在極大螺旋藻生長比較敏感的前期，對其抑制作用較小，從而生物量能較快積累。所有添加方式在添加800μg/mL的前提下，均未能消除對極大螺旋藻生長的抑制作用。

2.4 硒添加方式對富硒效果的影響

因?qū)嶒灲M1嚴(yán)重抑制螺旋藻生長，故不考慮此種方式對極大螺旋藻富硒的影響。實驗組2因添加時間較晚，富集硒量較少，且沒有得到很好的轉(zhuǎn)化。等量添加方式下極大螺旋藻達(dá)到最高有機(jī)硒含量，且有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率最高。可能原因為極大螺旋藻在早期已適應(yīng)高含量的硒濃度，后期生長的藻的富硒能力較強。結(jié)合圖4和表4可以看出，硒對極大螺旋藻生長和富集硒具有不同步性。雖然方式3條件下，極大螺旋藻的生物量不是很高，但與實驗組4、5相差不多，但胞內(nèi)有機(jī)硒含量有較大的優(yōu)勢，為得到優(yōu)質(zhì)的高富硒量的極大螺旋藻，仍然以等量添加作為最好的添加方式。

表4 硒添加方式對極大螺旋藻富硒效果的影響Table4 Effect of selenium addition mode on the enrichment of selenium in S. maχima

3 結(jié) 論

極大螺旋藻對硒具有極強的耐受能力和吸收轉(zhuǎn)化能力，以等量多次添加的形式添加800μg/mL的硒，生物量略有下降，但仍能生長正常，并能獲得較高的總硒及有機(jī)硒含量，有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率可達(dá)95%以上。確定此方法為收獲高質(zhì)量的富硒極大螺旋藻的最佳條件。該實驗結(jié)果與許多文獻(xiàn)[20-23]相比，富硒能力較強，除培養(yǎng)條件略有差別外，主要原因為藻種不同。其次，由于螺旋藻生長特性限制，實驗重復(fù)性較差些，致使條件一致時，結(jié)果略有不同。可以看出，螺旋藻藻種不同，培養(yǎng)條件不同，會很大程度影響富硒螺旋藻的富硒量和生物量。本實驗未能消除800μg/mL 硒添加量，等量添加方式下硒對極大螺旋藻的抑制作用，可進(jìn)一步考慮從改良藻種和改變培養(yǎng)條件等方面，提高富硒極大螺旋藻的生物量，為研究富硒螺旋藻的高密度培養(yǎng)以及從中提取含硒活性物質(zhì)打好基礎(chǔ)。

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Cultivation of Selenium-Enriched Spirulina maχima

YANG Ying-ying1，GUAN Bin1,*，KONG Qing1，YOU Yong1，GAO Yan-yan1，ZHANG Rui-qin1，LI Xiao1，ZUO Tao1，LIU Jin-chang2，HOU Qing-yun2
(1. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China；2. Research and Development Center, Yantai Shinho Food Co. Ltd., Yantai 264006, China)

In order to achieve selenium enrichment in Spirulina maχima, the effects of different amounts and strategies for selenium addition on the growth of S. maχima as indicated by biomass and selenium concentration were explored. The addition of 100μL of 100 μg/mL Na2SeO3 at the same time each day for 8 consecutive days after 1 day of growth in Se-free environment was found optimal, resulting in a biomass of 0.903g/L and an organic Se content of 1413.168 μg/g dry S . maχima.

Spirulina maχima；selenium addition amount；selenium addition mode；biomass；organic selenium content

TS201.1

A

1002-6630(2012)01-0106-05

2011-01-22

國家自然科學(xué)基金項目(31000823)；山東省自然科學(xué)基金項目(ZR2010CM050)

楊瑩瑩(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為食品生物工程。E-mail：yangyingying923@163.com

*通信作者：管斌(1957—)，男，教授，博士，研究方向為酶工程。E-mail：guanbin@ouc.edu.cn