田大偉，陳業(yè)剛，劉 鵬，湯 洋，王建民，韓瑞發(fā)

實驗研究

姜黃素聯合舒尼替尼治療人786-0腎癌裸鼠移植瘤

田大偉1，陳業(yè)剛2，劉 鵬2，湯 洋1，王建民1，韓瑞發(fā)1

目的：探討姜黃素聯合舒尼替尼對抑制人腎癌細胞系786-0裸鼠移植瘤生長有無增效作用。方法：將32只人腎細胞癌裸鼠隨機分為4組，陰性對照組以0.9%生理鹽水0.2 mL腹腔注射，舒尼替尼組以舒尼替尼40 mg/kg腹腔注射，姜黃素組以姜黃素100 mg/kg腹腔注射，研究組以舒尼替尼聯合姜黃素腹腔注射。結果：研究組較其他3組具有更強的抑瘤作用，遠期效果高于舒尼替尼組（P＜0.05）；研究組比舒尼替尼組抗血管增殖作用更加明顯（P＜0.01）；凋亡指數明顯高于其他3組（P＜0.05）。結論：姜黃素聯合舒尼替尼抑瘤作用明顯強于單獨應用舒尼替尼或姜黃素。

姜黃素；舒尼替尼；腎癌；裸鼠；移植瘤

腎細胞癌對于化療、放療不敏感，舒尼替尼是其晚期的一線用藥。但是隨著舒尼替尼的應用時間延長，出現了舒尼替尼各種藥物副作用及耐藥性。因此如何減少舒尼替尼的副作用及延緩耐藥性發(fā)生又成為了人們研究的新的方向。姜黃素是姜黃屬藥用植物中的多酚性藥用成分，在防治腫瘤等方面有明顯作用[1]。研究應用姜黃素聯合舒尼替尼進行人腎癌ACNH裸鼠移植瘤抗血管動物實驗，為中西醫(yī)結合治療惡性腫瘤尋找新的道路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 BALB/c裸小鼠,6～8周齡,雄性,體質量19～23 g。購自中國科學院上海實驗動物中心, SPF實驗室飼養(yǎng)。

1.1.2 細胞系 786-0(人)腎透明細胞癌，由天津醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院泌尿外科研究所贈予。

1.1.3 藥物與試劑 姜黃素由天津市中西醫(yī)結合醫(yī)院贈予；兔抗人CD34多抗（購自香港Abcam公司）；舒尼替尼由輝瑞默沙東公司贈予。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及裸鼠模型建立 人腎透明細胞癌細胞株786-0用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素RPMI-1640培養(yǎng)液,在37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取指數生長期的786-0細胞經胰酶消化分散,PBS洗滌2次,1000 r/min離心5 min,重懸于PBS中,調整細胞濃度為2×l07/mL。取100 μL(2×106個細胞/只)分別接種于32只裸鼠右肋皮下,SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2.3 實動物分組及給藥 待成瘤直徑約6 mm，經統(tǒng)計學檢驗腫瘤體積無顯著性差異(P＞0.05)，將荷瘤小鼠隨機分為4組，每組8只，共32只。陰性對照組（A組）：生理鹽水0.2 mL腹腔注射，隔日1次，共10次。舒尼替尼組（C組）：舒尼替尼40 mg/kg腹腔注射,隔日1次，共10次。姜黃素組（B）：姜黃素100 mg/kg腹腔注射，隔日1次，共10次。研究組（D組）：舒尼替尼聯合姜黃素劑量及用法同上。

1.2.4 裸鼠腫瘤體積測定 給藥后1周開始檢測腫瘤體積變化，每隔3 d記錄裸鼠皮下移植瘤大小及全身情況變化,并用游標卡尺測量瘤體最長徑(a)與最短徑(b)，計算腫瘤體積:V(mm3)=ab2/2，繪制腫瘤生長曲線。1.2.5 免疫組化檢測 30 d觀察結束處死裸鼠，取瘤體稱重，標本經10%福爾馬林固定，石蠟包埋。作4 μm厚連續(xù)切片3張，采用SP法染色，按照免疫組織化學常規(guī)步驟操作,一抗為兔抗人CD34多克隆抗體。抗體稀釋比均為1∶100。

1.2.6 TUNEL檢測腫瘤組織細胞的凋亡 根據TUNEL反應檢測試劑盒說明書操作。鏡下觀察,并數5個以上高倍視野,每個視野200個細胞,計數1000個細胞,陽性細胞數以百分數表示,即為腫瘤細胞凋亡指數(AI)。

2 結果

2.1 腫瘤生長曲線 裸鼠腹腔注射給藥8 d，C、D組與A、B組比較顯示出較強抑制腫瘤生長作用(P＜0.05)，A組與B組無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。第15 d，B組腫瘤體積開始明顯小于A組(P＜0.05)。在以后的觀察期間內，B、C、D組在15 d、20 d、25 d、30 d的腫瘤體積均明顯小于A組(P＜0.05)。第14 d，D組與C、B組相比，腫瘤體積減小(P＜0.05)。說明舒尼替尼聯合姜黃素治療的遠期效果較單獨應用舒尼替尼明顯加強。從腫瘤的體積生長變化曲線來看（圖1、表1），D組腫瘤生長明顯慢于其他各組，進一步說明了舒尼替尼聯合姜黃素對腎細胞癌腫瘤生長有明顯的抑制作用。通過對裸鼠生存期的觀察，我們看到A組自治療后14 d小鼠開始出現死亡。到觀察期45 d結束，A、B、C三組中最多只有5只小鼠存活，而舒尼替尼聯合姜黃素組小鼠死亡1只，存活率達到88.5%，相比其他組差異性顯著(P＜0.05)。表明聯合治療組可以明顯延長荷瘤小鼠的生存期。

圖1 裸鼠瘤體體積變化曲線

表1 各組人腎細胞癌荷瘤裸鼠體積各時間點對比

2.2 移植瘤組織細胞凋亡 TUNEL法檢測細胞凋亡，在D組標本中，發(fā)現大量的棕色的凋亡細胞，和變性空泡，明顯較其他各組凋亡細胞較多。D組的凋亡指數為（77.12±14.59）%，A組（21.43± 42.09）%，B組（43.07±7.13）%，C組（52.35%± 9.74）%，（P＜0.05，圖2）。

2.3 微血管密度免疫組化 以高倍鏡（×200）鏡下觀察腎細胞膜被染成棕黃色或細胞質內出現棕黃色顆粒為陽性細胞，利用Image Pro Plus，（IPP）軟件圖像半定量分析技術，根據陽性細胞光密度總值（IOD）判定，A組IOD（66 191.90±5419.85）；B組IOD（47 004.11±4218.09）；C組IOD（30 195.50±9442.82）；D組（15 575.72±6006.50）。D組MVD較A、B、C3組減少（P＜0.01，圖3，表2）。

圖2 細胞凋亡指數(TUNEL)

圖3 微血管密度免疫組化200

表2 微血管密度表達

3 討論

腎細胞癌（RCC）在泌尿外科惡心腫瘤疾病中僅次于膀胱移行細胞癌位居第二位。而腎細胞癌作為富血管惡性腫瘤，其腫瘤的生長、侵襲、轉移都依賴于腫瘤血管的生成。近年來，隨著對Von Hippel-Lindau基因和HIFα信號通路的深入研究，RCC發(fā)病的分子機制逐漸闡明，針對RCC細胞不同靶點的分子靶向藥物陸續(xù)問世。舒尼替尼作為抗腎細胞癌血管生成藥物，則作為目前治療RCC的一線用藥。與經典的細胞因子藥物相比，舒尼替尼能夠明顯改善晚期轉移性RCC患者的生存狀況，ORR達到11%～47%，PFS為5～11個月，OS延長至19～26個月[2-3]。隨著舒尼替尼在臨床上的推廣應用，舒尼替尼的毒副作用也逐漸體現出來，尤其在心血管和腎臟功能方面。一項包括來自13個臨床中心共4999例RCC和其他惡性腫瘤患者的資料顯示[4]，接受舒尼替尼治療者可以出現高血壓和腎功能衰竭，所有級別的高血壓和3級高血壓的發(fā)生率分別為21.6%和6.8%，危險性隨著腫瘤的類型和服用舒尼替尼的量而變動。與對照組相比，接受舒尼替尼治療患者3級高血壓和腎功能衰竭的危險性明顯增加（P＜0.01）。Telli等[5]的研究評估了48例應用舒尼替尼的患者，其中7例出現3或4級左室衰竭癥狀，出現時間為22～435 d，且3例停藥后仍持續(xù)存在心功能衰竭。舒尼替尼不良反應除了心血管系統(tǒng)外，對于骨骼、血液和內分泌等系統(tǒng)的不良反應也相繼報道。且隨著舒尼替尼服用時間延長，其藥物副作用也逐漸加重。因此，如何降低舒尼替尼的副作用損害，提高其藥物效價，成為了目前人們關注的焦點。

中醫(yī)中藥對惡性腫瘤的治療有其自身的特點，很多中藥成分都具有抑制惡性腫瘤的作用。姜黃素是一種植物多酚,來源于姜黃、郁金、莪術、石菖蒲等的根莖,化學結構為C21H20O6。近年研究發(fā)現，姜黃素針對惡性腫瘤藥理作用廣泛,其中姜黃素具有明顯的誘導癌細胞凋亡和抑制腫瘤血管增殖作用[6]。Brandt等[7]研究發(fā)現,姜黃素通過JNK/c-Jun/AP-1信號轉導通路,實現了galectin-1所誘導的細胞凋亡。Wang等[8]在研究姜黃素對肝癌HepG2細胞的凋亡的誘導作用時發(fā)現,姜黃素能夠抑制細胞生長,改變細胞表面表型形態(tài)。通過細胞內的游離鈣離子濃度干擾細胞線粒體膜的狀態(tài)，來抑制細胞生長,并抑制凋亡通路下游的效應Caspase-3和Caspase-7而發(fā)揮誘導凋亡的作用。有研究報道[9]，姜黃素能誘導Bcl-2及Caspase-8的差異性表達。Bcl-2蛋白家族在細胞凋亡中有著重要的調節(jié)作用,目前Bcl-2是凋亡分子機制研究的主要靶分子。Caspase-8是死亡受體介導的凋亡途徑中關鍵的啟動因子,細胞凋亡依賴一類對天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶產生的級聯反應。Caspase-8能夠通過寡聚而自身切割活化,并能激活下游半胱氨酸蛋白酶,產生凋亡效應[10]。劉巖等[11]通過體外實驗發(fā)現，姜黃素可以明顯的促進RCC細胞凋亡，并且發(fā)現姜黃素可以下調基質蛋白酶MMP9及MMP2的表達，起到抗腫瘤侵襲的作用。因此認為，姜黃素具有抑制腫瘤侵襲與轉移作用。本實驗通過對裸鼠瘤體標本進行TUNEL檢測發(fā)現，在單獨使用姜黃素時，較空白對照組使腎細胞癌凋亡率有所升高，具有明顯統(tǒng)計學意義。聯合舒尼替尼治療時，其導致RCC細胞凋亡率則較其他3組更高（P＜0.05），姜黃素有可能增強了舒尼替尼促腫瘤細胞凋亡作用。

近年研究發(fā)現，姜黃素可以明顯抑制腫瘤血管的增殖。丁志山等[12]建立了姜黃素雞胚絨毛尿囊膜血管生成模型，發(fā)現姜黃素具有明顯的抑制血管生成作用并且與計量成正相關。Weissenberger等[13]研究顯示,姜黃素可抑制JAK1,2/STAT3信號傳導通路的活性,還可抑制72-kd MMP的表達和轉錄,說明姜黃素可在轉錄和轉錄后水平調節(jié)基質金屬酶蛋白(matrix metallop roteinase,MMP)發(fā)揮抑制血管生成作用。MMP在腫瘤轉移和降解過程中可發(fā)揮重要作用,姜黃素則被發(fā)現可通過抑制MMP活性來抑制血管生成[14]。本實驗研究通過對比各組荷瘤裸鼠瘤體標本的MVD免疫組化結果發(fā)現，在單獨應用姜黃素時，其對腫瘤血管抑制作用較空白組有差異（P＜0.05），而與舒尼替尼聯合應用后，其治療效果明顯高于其他3組（P＜0.01）。

通過對舒尼替尼聯合姜黃素治療人腎細胞癌發(fā)現，姜黃素可以明顯的提高舒尼替尼的治療效果，增強其抑制腫瘤血管增生和促進RCC細胞凋亡作用，使其具有更強的抑瘤作用。尤其在應用聯合治療后2周左右，其效果較單獨用藥更加明顯。這可能與隨著中藥用量的增加引起藥物濃度的蓄積，加強了其效果有關。這也與通常中藥療效相符，說明聯合用藥在長期服用后起遠期效果更佳。我們也發(fā)現，在單獨應用姜黃素時，其治療效果并不明顯。認為有可能存在以下原因，⑴標本例數較少，因為經費所限無法取得大樣本數據，所以統(tǒng)計結果有可能存在缺陷。⑵中藥有其自身特性，受其劑量、提取工藝及服藥時間長短等多因素限制，尤其是用藥時間長短，目前并沒有一個科學的界定。本實驗在姜黃素和舒尼替尼劑量上沒有進行相關分組，不同舒尼替尼用量聯合姜黃素，是否也能得到滿意的治療效果，是我們下一步的研究目的。如果在減少舒尼替尼的劑量后聯合姜黃素仍能達到很好的治療效果則可以在一定程度上減少舒尼替尼帶來的藥物副作用，和患者的經濟負擔從而進一步體現中西醫(yī)結合治療的優(yōu)越性,為中西醫(yī)結合治療惡性腫瘤開拓一條新的道路。

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（收稿：2012-06-08 修回：2012-08-26）

（責任編輯 劉洪斌）

Experimental Study of Treatment Effect of Curcumin and Sunitinib on Transplanted Renal Clear Cell Carcinoma in Nude Mice

TIAN Da-wei,CHEN Ye-gang,LIU Peng,et al.Second Hospital of Tianjin Medi?

cal University,(300211),China

Objective To study whether curcumin could potentiate the antitumor effect of sunitinib on xeno?grafted tumor growth of human renal clear cell carcinoma in nude mice.Methods Thirty two nude mice bear?ing human renal clear cell 786-0 xenografted tumor were randomly divided into 4 groups(n=8 in each group): control group(0.2 mL 0.9%NS,intraperitoneal injection),sunitinib group(40 mg/kg,intraperitoneal injection), curcumin group(100 mg/kg,intraperitoneal injection),and the combination group of curcumin and sunitinib. Results Compared with the other three groups,the combination group of curcumin and sunitinib demonstrated significant tumor growth inhibition(P＜0.05),the combination group could significantly slow down tumor growth,especially for a forward treatment effect than used sunitinib group alone(P＜0.05).The cell apoptosis in?dex(TUNEL)showed that combination group apoptosis index was significantly higher than those in the other three groups(P＜0.05).Combined treatment group showed more obvious action against vascular proliferation function than contrast used sunitinib alone(P＜0.01). Conclusion The combination group of curcumin and sunitinib leads to suppression of tumor obviously better than used sunitinib or curcumin alone,therefore curcum?in may become sunitinib sensitizers and improve the treatment effect.

Curcumin；sunitinib；renal cancer；nude mice；transplantation tumor

Q95-33；R737.11

A

1007-6948(2012)05-0469-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2012.05.011

1.天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院泌尿外科（天津 300211）

2.天津市南開醫(yī)院（天津 300100）

韓瑞發(fā)；E-mail:jianshi001@126.com