10%中性緩沖福爾馬林配制中應注意的問題

陳余朋，王行富，王 密，王鵬程

福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科(福建 福州 350005)

10%中性緩沖福爾馬林溶液(pH值7.2～7.4)是臨床診斷及實驗病理學中最常用的固定劑，具有較強的組織穿透能力，組織收縮小，固定均勻、穩(wěn)定，能使組織硬化，保證HE制片的高質量；能更好的保持組織的抗原性[1,2]，有利于免疫組織化學標記物的檢測。研究[3]表明用10%中性緩沖性福爾馬林固定劑的石蠟組織提取的DNA在質量上明顯優(yōu)于普通的非緩沖型福爾馬林固定劑。ASCO /CAP HER-2檢測指南和我國2009年HER2基因檢測指南指出，組織處理的標準化固定劑為10%中性緩沖福爾馬林, 以獲得最佳的原位免疫熒光檢測[4,5]。目前很多醫(yī)院尤其基層單位在10%中性緩沖福爾馬林配制上并不規(guī)范，主要有以下問題應引起同行重視。

試劑稱重的準確性按照臨床病理技術操作規(guī)范[1]，10%中性福爾馬林固定液的配制方法(1000 ml)：甲醛(40%)100 ml，無水磷酸氫二鈉6.5 g，磷酸二氫鈉4 g，蒸餾水900 ml。該配制方法并不能直接準確地配制10%的中性緩沖福爾馬林，因為其中磷酸二氫鈉并沒注明是無水還是含一水化合物(NaH2PO4·H2O)或二水化合物(NaH2PO4·2H2O)，使用不同磷酸二氫鈉的量將直接影響最終的pH值。按照《組織學技術的理論與實踐》介紹的10%中性福爾馬林的配制方法[2]:福爾馬林(37%-40%的甲醛溶液) 100 ml，Na2HPO46·5 g，NaH2PO4·H2O 4 g，蒸餾水900 ml,pH值應為7.2-7.4, 該配方明確磷酸二氫鈉是一水化合物，只要這樣準確稱量，準確配制，pH值即為7.2～7.4。用于配制10%中性緩沖福爾馬林的最常用的Na2HPO4有兩種形式即無水Na2HPO4和Na2HPO4·12H2O；最常用NaH2PO4也有兩種形式即NaH2PO4·H2O和NaH2PO4·2H2O。在選擇試劑的時候應該注意所購買的試劑Na2HPO4和NaH2PO4是否含有或含有幾個水分子化合物，應根據(jù)M=m/n進行換算，準確稱量，嚴格配制并監(jiān)測緩沖液的pH值，避免發(fā)生不必要的錯誤。當選擇Na2HPO4·12H2O和NaH2PO4·2H2O時，根據(jù)M=m/n，換算Na2HPO4·12H2O和NaH2PO4·2H2O量分別為16.38 g和4.52 g，準確稱量，準確配制，pH值應為7.2～7.4。

試劑的保存Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·H2O、NaH2PO4·2H2O等，其水化含量在自然狀態(tài)下并非一成不變，如果試劑密封不好，可能在干燥空氣中風化，失去結晶水，例如Na2HPO4·12H2O在空氣中風化后，極易失去五分子結晶水而形成七水化合物Na2HPO4·7H2O，分子量發(fā)生變化，影響試劑的準確稱量。無水磷酸氫二鈉略有吸濕性，在濕空氣中易水化結塊。因此試劑要求密封保存。

pH值檢測準確測pH值一般選用pH計進行，pH計可以精確到0.1～0.01。pH試紙只能精確到1～0.1。造成這種差異的原因是，pH計測量pH是靠感應器感應、滲透壓或別的參數(shù)測量，因此科學精確；pH試紙靠特殊顏色反應，不僅人眼對色覺的鑒定會造成誤差，另外，比色卡的印刷也會造成一定誤差，都會導致判讀不夠精準。在質控檢查的時候，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)用pH值試紙檢測的10%中性緩沖福爾馬林實際偏酸性。

質量控制對所配制的10%中性緩沖福爾馬林，要制定嚴格的質量控制制度，定期測量pH值。中性緩沖福爾馬林的試劑要徹底溶解，并且攪拌均勻，配好的中性緩沖福爾馬林溶液要用密閉的塑料桶存放，以防福爾馬林揮發(fā)。日常配制中性混合磷酸鹽緩沖液時，其pH值往往因化學試劑質量、技術質量等因素稍有誤差，可酌加少量1M Na2HPO4或1M NaH2PO4溶液校正后使用[6]。

試劑質量 建議購買分析純(AR)試劑，分析純主成分含量很高、純度較高，干擾雜質很低，適用于工業(yè)分析及化學實驗。試劑要符合國家標準，選擇外包裝完好無損，試劑瓶口密封，生產日期越新越好，在有效日期范圍內，選擇質量可靠的廠家。當選擇有破損、不夠密封、過期的含水化合物試劑，可能會出現(xiàn)含水化合物試劑在空氣中風化，失去結晶水；有吸濕性的試劑在濕空氣中易水化結塊，從而影響試劑的質量和配制稱量的準確性。

配制人員職業(yè)責任感目前基層病理工作存在一些問題，病理工作單調，不受重視，導致少數(shù)人員工作積極性不高，責任感不強等，從而影響試劑的配制質量。每個科室或研究單位應該形成質量檢測和質量控制制度，由專人配制，專人管理，對每批次的試劑配制做好記錄，并實行每天監(jiān)測pH值。質控小組隨機抽查，對于不合格的試劑誤差不大時，進行必要調整，明顯誤差者直接按照廢液處理，確保配制試劑的質量。

10%中性緩沖福爾馬林配制的好壞直接影響組織的固定，組織固定的好壞直接影響制片質量、HE染色效果、特殊染色、免疫組化染色以及分子生物學方面的檢測。因此正確配制10%中性緩沖福爾馬林至關重要，同時作為一個合格的病理技術人員，除了要有過硬的專業(yè)技術，還要有高度的職業(yè)責任感，認真對待、科學處理組織固定的每一步驟，為病理診斷、免疫組化及分子生物學的檢測打好堅實的基礎。

[1] 中華醫(yī)學會編著.臨床技術操作規(guī)范 病理學分冊[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2004：28.

[2] John D.Bancroft,Mariln Ganmble主編，周小鴿，劉勇主譯.組織學技術的理論和實踐[M].北京：北京大學醫(yī)學出版社，2010：45-57.

[3] Zsikla M，Baumann G.Effect of buffered formalin on amplification of DNA from paraffin wax embedded small biopsies using real-time PCR[J].Journal of clinical pathlogy,2004,57:654-656.

[4] Wolff AC,Hammond ME,Schwartz JN,et al.American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendation for human epidermal growth factor 2 testing in breast cancer[J].Arch pathol Lab Med,2007,131(1):18-43.

[5] 《乳腺癌HER-2檢測指南》編寫組.乳腺癌HER-2檢測指南(2009版)[J].中華病理學雜志，2009，38(12)：836-840.

[6] 趙寶忠，孫智才，劉增輝，等.對福爾馬林固定劑相關理論的再認識[J].臨床與實驗病理學雜志，2007，25(3)：337-338.