新型基因表達調(diào)控元件——人工核糖開關(guān)的構(gòu)建及篩選

楊會勇，刁勇，林俊生，許瑞安

1 華僑大學(xué)分子藥學(xué)物研究所，福建 泉州 362021

2 分子藥物教育部工程研究中心，福建 泉州 362021

近年來基因治療在人體臨床試驗中取得重大成功，標志該技術(shù)的有效性和安全性已獲得重大突破[1]，但如何按照病情需要實時調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達水平，仍然是困擾該領(lǐng)域研究人員的難題[2]。以腎性貧血的基因治療為例[3]，促紅細胞生成素(EPO) 表達水平的過高表達會引起紅細胞過度增生，從而引起心肌梗塞腦血栓等嚴重不良反應(yīng)，其危害可能等同甚至大于 EPO基因治療本身帶來的益處。糖尿病的基因治療，則對胰島素表達的時間節(jié)點和水平均有很高要求[2]。本課題組曾采用轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件調(diào)節(jié)以重組腺相關(guān)病毒為載體的基因藥物 (rAAV-Ins) 的表達[4]。小鼠口服rAAV-Ins后，胰島素表達可以在1年的時間內(nèi)隨血糖水平而調(diào)整。但遺憾的是，胰島素表達的高低與血糖水平變化之間有數(shù)小時的時滯，無法真正應(yīng)用于臨床。

長期以來，生物體內(nèi)基因表達的調(diào)控一直被認為是蛋白的“專利”。蛋白類轉(zhuǎn)錄因子的表達調(diào)控系統(tǒng)在基因治療臨床前及部分臨床研究中取得了一定的成功[2,5]，但蛋白調(diào)控系統(tǒng)必須將編碼蛋白因子的基因與治療基因一起轉(zhuǎn)染細胞，外源蛋白的免疫原性成為臨床應(yīng)用面臨的首要問題。另外系統(tǒng)元件體積大、調(diào)節(jié)響應(yīng)時間長等也是限制其臨床應(yīng)用的主要缺點。多種具有基因表達調(diào)控功能的RNA元件的發(fā)現(xiàn)再一次挑戰(zhàn)了傳統(tǒng)分子生物學(xué)中心法則中關(guān)于RNA功能的定義[6]，其中一類是首先在細菌mRNA的5￠端非編碼區(qū) (5￠UTR) 中發(fā)現(xiàn)的核糖開關(guān) (Riboswitch)。目前發(fā)現(xiàn)的天然核糖開關(guān)均僅由一段35~200 bp的核苷酸序列組成，其結(jié)構(gòu)與蛋白比較如此簡單，以至于在發(fā)現(xiàn)之初被認為其行使基因調(diào)控的能力非常有限。但深入的研究表明，核糖開關(guān)在基因表達調(diào)控方面所具有的功能與蛋白相比毫不遜色[7]。核糖開關(guān)對基因表達的調(diào)控不需要蛋白因子參與，免疫原性小；元件大小在數(shù)百堿基之內(nèi)，構(gòu)成非常簡單；響應(yīng)配體時間一般在數(shù)分鐘之內(nèi)，反應(yīng)迅速；核糖開關(guān)位于mRNA之上，發(fā)揮順式調(diào)節(jié)作用，可實現(xiàn)緊密調(diào)節(jié)[8]。與蛋白調(diào)控系統(tǒng)相比較所表現(xiàn)出的諸多優(yōu)點，使得核糖開關(guān)自發(fā)現(xiàn)之日起就引起了廣泛關(guān)注，日益深入的研究結(jié)果顯示其可以在代謝物檢測、新藥研制、基因表達調(diào)控等多個方面發(fā)揮重要作用[9]。

1 重組核糖開關(guān)的構(gòu)建

1.1 簡化核糖開關(guān)

天然核糖開關(guān)在結(jié)構(gòu)上可分為適體域與表達平臺域兩部分，但部分核糖開關(guān)的適體域與表達平臺域在結(jié)構(gòu)上合二為一，即簡化核糖開關(guān)。早在正式提出核糖開關(guān)概念的4年前，Werstuck等就成功組建了一種簡化核糖開關(guān)[10]。他們將配體為毒性小、可穿透細胞膜的染料H33258的2種適體 H10和 H19串聯(lián)插入 Lac Z基因的5￠UTR，得到可在哺乳細胞內(nèi)發(fā)揮作用的核糖開關(guān)。當(dāng)在細胞培養(yǎng)基中加入配體后，插入 H10和H19適體序列與配體結(jié)合，阻礙了mRNA翻譯啟動，Lac Z基因表達水平可降低90%。該研究不僅證明采用基因重組技術(shù)創(chuàng)建核糖開關(guān)的可行性，還首次證明主要存在于原核生物的核糖開關(guān)在真核細胞內(nèi)也可以發(fā)揮作用。

之后不同研究小組陸續(xù)報道了數(shù)種簡化核糖開關(guān)的構(gòu)建，但所有的簡化核糖開關(guān)均表現(xiàn)為抑制型基因調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果表明，簡化核糖開關(guān)插入 mRNA的位置，決定了其作用機制是阻斷核糖體43S亞單位與mRNA帽子結(jié)構(gòu)的結(jié)合，還是干擾核糖體對mRNA掃描[11]，多個適體結(jié)構(gòu)串聯(lián)應(yīng)用有助于調(diào)節(jié)配體的量效動力學(xué)范圍[12]。

1.2 復(fù)雜核糖開關(guān)

與簡化核糖開關(guān)不同，一個復(fù)雜核糖開關(guān)中含有相對獨立的適體域和表達平臺域，兩區(qū)域則由接頭序列相連接。據(jù)研究，復(fù)雜核糖開關(guān)中適體區(qū)域相對保守，而基因表達平臺域則有很大變化，甚至同一個配體小分子有多個作用機制不同的核糖開關(guān)對應(yīng)[13]。因此，構(gòu)建這類核糖開關(guān)時，一般是首先獲得高度特異和高親和力結(jié)合配體小分子的適體區(qū)域，然后根據(jù)需要選擇合適的表達調(diào)控機理，最后通過連接元件組裝成完整的核糖開關(guān)。

根據(jù)作用機理，復(fù)雜核糖開關(guān)可分為轉(zhuǎn)錄終止、翻譯啟動和 mRNA剪切等類型。當(dāng)適體域與特定配體結(jié)合后，核糖開關(guān)的構(gòu)象隨之發(fā)生改變，從而影響 mRNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯起始或前體剪接過程[14-16]。

1.2.1 轉(zhuǎn)錄終止型復(fù)雜核糖開關(guān)

轉(zhuǎn)錄終止子是一種末端含有 polyU尾巴的RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其中 polyU尾巴對終止子的功能至關(guān)重要，但不影響其莖環(huán)折疊。當(dāng)RNA聚合酶進行 mRNA的轉(zhuǎn)錄時，如遭遇轉(zhuǎn)錄終止子的莖環(huán)結(jié)構(gòu)便從轉(zhuǎn)錄模板脫落，下游序列的轉(zhuǎn)錄隨之終止。轉(zhuǎn)錄終止是天然核糖開關(guān)的常用機制，數(shù)個轉(zhuǎn)錄終止型核糖開關(guān)串聯(lián)可實現(xiàn)基因表達的嚴密調(diào)節(jié)[17]。Fowler等[18]選用茶堿適體TCT8-4組成適體域，以來源于枯草桿菌的MetI基因轉(zhuǎn)錄終止子為表達平臺，從含有抗終止子序列的文庫中篩選產(chǎn)生接頭序列，嘗試構(gòu)建一種轉(zhuǎn)錄終止型核糖開關(guān)。很遺憾的是，該核糖開關(guān)的最終作用機制并不是轉(zhuǎn)錄終止，因為將終止子的polyU尾序列突變甚至敲除終止子后，其基因調(diào)控作用仍然保留。

1.2.2 翻譯啟動型復(fù)雜核糖開關(guān)

核糖體結(jié)合位點 (RBS) 是位于mRNA上游的特異序列，核糖體通過識別并結(jié)合 RBS啟動翻譯過程。在原核生物中該序列稱為SD序列，在真核生物中則稱為Kozak序列。Desai等[19]將茶堿適體插入LacZ報告基因RBS上游，適體序列與表達平臺形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)將RBS屏蔽在內(nèi)，阻斷了翻譯啟動過程。當(dāng)加入茶堿后，適體與茶堿結(jié)合形成新的構(gòu)象，將表達平臺域中的 RBS暴露在外，有利于核糖體參與的翻譯啟動。與大部分天然核糖開關(guān)不同，該核糖開關(guān)表現(xiàn)為激活型基因調(diào)控作用，基因表達水平呈配體劑量依賴性增加，最大激活指數(shù) (激活后與激活前基因表達水平的比值) 可達8倍。因適體域和表達平臺間接頭序列的長度和堿基類別對激活指數(shù)以及配體的量效動力學(xué)范圍均有顯著的影響，采用細胞內(nèi)篩選法對接頭序列進一步優(yōu)化，可提高激活指數(shù)至36倍[20]。繼續(xù)對RBS序列同步優(yōu)化，又可以提高激活指數(shù)至96倍[21]。

1.2.3 mRNA剪切調(diào)控型復(fù)雜核糖開關(guān)

在真核生物細胞內(nèi)，mRNA前體的可變剪切既可產(chǎn)生功能不同的蛋白，又可以作為基因表達的有效調(diào)控手段[22]。近年來相繼在真菌及植物細胞mRNA的5￠端和3￠端UTR以及編碼區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)核糖開關(guān)的存在，表明 mRNA選擇剪切型核糖開關(guān)能夠在真核細胞內(nèi)有效發(fā)揮基因表達調(diào)節(jié)的作用[23-26]。一般 mRNA前體的一個有效的剪切部位形成需要包含3個識別位點：5￠端識別位點、分支序列和3￠端識別位點。研究表明[27]：當(dāng)剪切識別位點處于 mRNA前體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖結(jié)構(gòu)內(nèi)時，即被屏蔽而無法被剪切復(fù)合體識別，對 mRNA前體內(nèi)含子的剪切過程也不再啟動。mRNA剪切調(diào)控型復(fù)雜核糖開關(guān)利用了這個特點：通過結(jié)合配體小分子，使剪切識別位點所處的莖環(huán)結(jié)構(gòu)環(huán)境發(fā)生改變，從而啟動或阻礙剪切過程。這也是目前所發(fā)現(xiàn)的真核生物中核糖開關(guān)唯一的調(diào)控機制。

mRNA前體的剪切過程分為2個階段。在第一階段，mRNA前體在5￠剪接位點被剪切，內(nèi)含子在分支序列處形成套索結(jié)構(gòu)，但仍然與第二外顯子連接在一起；在第二階段，第一外顯子最后一個核苷酸的3￠-羥基親核攻擊內(nèi)含子-第二外顯子套索結(jié)構(gòu)間3￠剪接位點的磷酸二酯鍵，從而使兩個外顯子相互連接，內(nèi)含子以套索結(jié)構(gòu)形式被釋放。Kim 等[28]將茶堿核糖開關(guān)插入到前體mRNA的3￠剪接位點，這種結(jié)構(gòu)可以在剪切過程的第二個階段抑制前體 mRNA的剪接?？紤]到在剪切過程的早期進行調(diào)控可能效率更高，Kim等[29]又嘗試將核糖開關(guān)插入到編碼區(qū)的內(nèi)含子中，并將內(nèi)含子的分支序列位于適體域的莖結(jié)構(gòu)內(nèi)，結(jié)果配體引起的核糖開關(guān)構(gòu)象改變形成新的發(fā)夾結(jié)構(gòu)將分支序列屏蔽，從而在第一階段抑制了 mRNA的剪接。適體形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，莖結(jié)構(gòu)的大小及分支序列在適體內(nèi)的位置，對剪切調(diào)控效率有明顯的影響。更有意思的是，該核糖開關(guān)還可以控制前體 mRNA的選擇性剪接。第一內(nèi)含子的分支序列被屏蔽，導(dǎo)致第二內(nèi)含子的分支序列在第一和第二內(nèi)含子2個5￠剪接位點間進行選擇。第二內(nèi)含子的分支序列如選擇第一內(nèi)含子的5￠剪接位點，則有利于形成不含第二外顯子的mRNA。如果將第一內(nèi)含子的分支序列以及第二內(nèi)含子的5￠剪接位點同時屏蔽，則有可能進一步提高不含第二外顯子的mRNA的形成比例。由于絕大多數(shù)人類基因都會采用選擇性剪接方式進行調(diào)節(jié)，所以選擇性剪接核糖開關(guān)可能對基因治療更為重要。

2 重組核糖開關(guān)的篩選

2.1 適體的體外篩選

核糖開關(guān)的設(shè)計，首先要確定欲采用的配體。理想的配體應(yīng)該具有可以透過細胞膜、細胞毒性小、胞內(nèi)背景水平低等條件。如要應(yīng)用于基因治療，最好是選擇諸如病情相關(guān)的指標性因子等為配體。理論上運用配體指數(shù)富集系統(tǒng)進化技術(shù) (Systematic evolution of ligand by exponential enrichment，SELEX) 可篩選得到任何指定配體的適體[30-33]。SELEX體外篩選RNA適體的基本過程為：首先運用化學(xué)合成技術(shù)建立一個含有核苷酸隨機序列的單鏈DNA (ssDNA) 文庫，經(jīng)過體外轉(zhuǎn)錄得到包含1015條左右不同序列的RNA文庫。采用物理方法 (如柱層析) 篩選與特定配體結(jié)合的RNA序列。結(jié)合反轉(zhuǎn)錄和PCR方法擴增所選擇的RNA序列得到新的dsDNA文庫。經(jīng)過10~15輪的建庫、篩選與擴增，最后得到RNA序列即為候選適體。對其中的序列逐一進行親和力和特異性的鑒定，符合要求的即確定為適體序列。對于一個配體一般可篩選得到數(shù)種序列各異的適體。為了獲得適體核心區(qū)域序列和構(gòu)象，我們開發(fā)了一種基于適體核心區(qū)域保護的聚合酶鏈式擴增反應(yīng) (ARP-PCR) 方法，以便對SELEX得到的候選適體進行精確篩選[32]。將與靶分子結(jié)合的候選適體分子采用Dnase Ⅰ酶進行酶切，處于單鏈狀態(tài)的未結(jié)合序列被降解，剩余的與靶分子結(jié)合的序列即為適體區(qū)域核心序列。之后對適體核心序列進行莖環(huán)結(jié)構(gòu)分析，可實現(xiàn)對適體核心區(qū)域的精確定位及序列構(gòu)象確認。在核糖開關(guān)構(gòu)建過程中，ARP-PCR方法還可用于檢測核糖開關(guān)結(jié)合配體小分子前后構(gòu)象變化，提高核糖開關(guān)體外篩選的效率。而目前核糖開關(guān)高級結(jié)構(gòu)分析多是應(yīng)用操作復(fù)雜的X-衍射方法[34]。

采用SELEX方法體外篩選的適體，并不一定能保證可作為核糖開關(guān)的有效部件，因體外篩選環(huán)境不能準確反映細胞內(nèi)的折疊條件。另外其文庫序列一般在1015條以下，最優(yōu)的適體序列或許未被包含在內(nèi)；多輪篩選過程也比較耗時。

光學(xué)波段包括可見光(380nm-760 nm)和近紅外(760nm-1200nm)，仿石器材的光譜曲線應(yīng)與真山石相近。

2.2 功能性核糖開關(guān)的細胞內(nèi)選擇

盡管基于SELEX體外篩選的適體可以成功構(gòu)建簡單的核糖開關(guān)，但其有效性在一定程度上具有偶然性。經(jīng)SELEX體外篩選得到適體，僅極少部分可以構(gòu)建成在體內(nèi)發(fā)揮作用的功能性核糖開關(guān)[35-36]。Weigand等[37]將50 000種候選適體序列進行細胞內(nèi)功能篩選，最終得到的最佳序列與SELEX體外篩選所得到的序列大相徑庭，說明對配體的親和力和專屬性僅僅是適體成為核糖開關(guān)的必要條件。

2.2.1 傳統(tǒng)遺傳篩選

遺傳篩選是檢測細胞中生物分子功能的最優(yōu)方法，因細胞的存活與其表現(xiàn)型密切相關(guān)，篩選得到的細胞一定帶有所需的特質(zhì)。為了保證構(gòu)建的核糖開關(guān)在細胞內(nèi)仍然具有調(diào)控功能，Desai等率先提出進行遺傳篩選的思路[19]。該方法的第一步是建立核糖開關(guān)文庫，然后轉(zhuǎn)染大腸桿菌進行遺傳特質(zhì)篩選。所采用的適體是經(jīng)體外篩選得到的茶堿適體，基因為氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶。當(dāng)核糖開關(guān)被茶堿激活后，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶得以大量表達，培養(yǎng)基內(nèi)的氯霉素被降解，大腸桿菌可存活，而不含有活性核糖開關(guān)的大腸桿菌均不能生長。將篩選出來的活性核糖開關(guān)與突變體以1∶1 000 000的比例混合，重新轉(zhuǎn)染大腸桿菌后，按照此方法仍然可以成功地將活性核糖開關(guān)挑選出來，證明了遺傳篩選方法的有效性。

Nomura等則利用雙重遺傳篩選方法對核糖開關(guān)進行優(yōu)化[38]，其采用的核糖開關(guān)為 TPP依賴型，調(diào)控的基因為tet A。有效表達tet A的大腸桿菌對四環(huán)素有抗藥性，但對氯化鎳敏感，而不表達tet A的大腸桿菌對四環(huán)素敏感，但耐受氯化鎳。通過這種方法，他們從75 000株克隆中成功選擇出優(yōu)化的功能性TPP核糖開關(guān)，激活指數(shù)達 11倍。將目的基因更換為綠色熒光蛋白等其他基因時，核糖開關(guān)的表達調(diào)控作用仍正常發(fā)揮，說明該開關(guān)可應(yīng)用于多種基因的表達調(diào)控。

傳統(tǒng)遺傳篩選方法雖然可以實現(xiàn)活性核糖開關(guān)的選擇，但這些開關(guān)的背景表達水平仍較高，核糖開關(guān)的激活指數(shù)也不夠理想。其原因可能是由于文庫的序列組成仍不夠多樣化，篩選標準是定性而不是定量指標，因此需要更新的篩選方法進行核糖開關(guān)的優(yōu)化。

2.2.2 高通量遺傳篩選

Lynch等將機器人輔助篩選技術(shù)應(yīng)用于核糖開關(guān)胞內(nèi)篩選，極大地提高了工作效率[20]?；诮宇^序列對核糖開關(guān)功能有顯著影響的認識，他們建立了由65 000種4~8個隨機堿基組成的接頭序列文庫。將含有接頭序列文庫的核糖開關(guān)轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，首先在含X-gal但缺乏配體茶堿的選擇性培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，把不表達報告基因LacZ的白色單菌落挑出，然后分別接種于含或不含茶堿的選擇性培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，比較同一菌落的激活指數(shù)。第一步在無茶堿的條件下選擇白色單菌落是為了降低背景表達水平，防止泄露效應(yīng)強的核糖開關(guān)被選擇。第二步是選擇激活指數(shù)高的核糖開關(guān)。在第一步篩選過程中，雖然99%的菌落是不需要的藍色菌落，但剩余1%的白色菌落數(shù)量就達到4 000株之多，所以必須采用機器人輔助系統(tǒng)才能進行有效選擇。

以細胞運動能力為選擇標準的篩選方法[39]，較上述機器人輔助系統(tǒng)操作簡便，可以很容易地在百萬級文庫內(nèi)進行篩選。該方法使用的基因為cheZ基因，其表達與否可使大腸桿菌的表現(xiàn)型在原地翻滾和平穩(wěn)泳動之間轉(zhuǎn)變。在 cheZ基因不表達的情況下，大腸桿菌在原地翻滾，在半固體瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)不發(fā)生遷移。當(dāng)cheZ基因表達時，大腸桿菌獲得平穩(wěn)泳動能力，可在培養(yǎng)基內(nèi)遷移。將大腸桿菌接種于半固體培養(yǎng)基中，選擇在無配體條件下保持在原地，但有加入配體后向周圍遷移的菌落，即可得到含有所需要的核糖開關(guān)的菌落。所篩選得到的核糖開關(guān)可以指導(dǎo)大腸桿菌沿著配體標記的T型線路遷移，進一步證明了該方法的有效性[40]。該方法僅需要一把標尺即可實現(xiàn)機器人輔助系統(tǒng)所具有的高通量篩選功能，值得推廣。但其缺點是，cheZ基因的過度表達會導(dǎo)致細胞陷于培養(yǎng)基內(nèi)部而失去活動能力，影響篩選效果。

3 存在問題與解決策略

3.1 配體與核糖開關(guān)結(jié)構(gòu)

天然核糖開關(guān)一般采用代謝產(chǎn)物作為調(diào)節(jié)其功能的配體。如果將重組核糖開關(guān)應(yīng)用于基因治療領(lǐng)域，天然代謝產(chǎn)物則不是配體的最佳選擇，因人體內(nèi)背景濃度的存在會干擾目的基因的緊密調(diào)控。生物利用度高、藥理學(xué)活性低、體內(nèi)毒性小的非天然小分子配體應(yīng)當(dāng)成為重組核糖開關(guān)的首選。雖然基于SELEX技術(shù)從理論上可以獲得任何配體的適體，但迄今為止，所獲得的能在生物體內(nèi)發(fā)揮調(diào)控作用的適體序列屈指可數(shù)，所用的配體幾乎均局限于茶堿、焦磷酸硫胺素 (TPP) 和新霉素等配體，不符合上述首選配體的條件。

在天然核糖開關(guān)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進行改造，結(jié)合化學(xué)篩選和遺傳篩選的手段，正交選擇非天然小分子配體的重組核糖開關(guān)，不失為解決上述問題的可選途徑。腺嘌呤是add A核糖開關(guān)的天然配體，通過與該核糖開關(guān)內(nèi)4個特定的尿嘧啶結(jié)合發(fā)揮基因調(diào)控作用[41]。將add A核糖開關(guān)的尿嘧啶定點突變，采用遺傳篩選技術(shù)考察 80種非天然腺嘌呤類似物的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)突變體M6與三聚氰酸二酰胺呈現(xiàn)劑量依賴性調(diào)控關(guān)系，但原配體腺嘌呤則失去了對M6的調(diào)控能力。與add A核糖開關(guān)相比，M6的基礎(chǔ)基因表達水平有所降低，推測是由于突變引起了轉(zhuǎn)錄子的錯誤折疊。對位于M6的P2莖結(jié)構(gòu)繼續(xù)定點突變，所得到的2種突變體M6’和M6”的基因表達水平明顯提高，但激活指數(shù)仍維持在M6的同等水平。

3.2 熱力學(xué)與動力學(xué)

配體對核糖開關(guān)的調(diào)控特征常用熱力學(xué)指標來評價。配體結(jié)合前后核糖開關(guān)熱力學(xué)穩(wěn)定性的差異可能是決定其基因調(diào)控能力的關(guān)鍵因素，因配體結(jié)合前后融點差異 (△Tm) 的大小與其基因調(diào)控能力成正比[36]。游離的核糖開關(guān)處于構(gòu)象可變的靈活狀態(tài)，可保證配體與其功能團發(fā)生交互作用。當(dāng)配體被包裹在核糖開關(guān)結(jié)合口袋之內(nèi)后，則形成穩(wěn)定的有序結(jié)構(gòu)[42-44]。如果熱力學(xué)性質(zhì)是核糖開關(guān)性能的決定因素，則可以通過比較配體結(jié)合前后熱力學(xué)常數(shù)，有效預(yù)測核糖開關(guān)的調(diào)控能力，并進一步實施定向改造。

除熱力學(xué)因素外，動力學(xué)也是影響核糖開關(guān)功能的重要因素。對于有足夠的時間與它們所處的環(huán)境保持平衡的核糖開關(guān)來說，解離常數(shù) (Kd)值是決定其是否因配體濃度做出反應(yīng)的唯一因素[41]。然而，對于部分轉(zhuǎn)錄終止型核糖開關(guān)，配體結(jié)合與RNA聚合酶反應(yīng)的速度競賽結(jié)果，決定了其發(fā)揮基因調(diào)控能力的高低[45-46]。在形成核糖開關(guān)的適體域后，如果配體結(jié)合速度不夠快，在終止子或反終止子構(gòu)象還未形成之時，聚合酶就已經(jīng)越過該段序列繼續(xù)完成 mRNA的合成，調(diào)控即宣告失敗。要成功實現(xiàn)調(diào)控可能需要胞內(nèi)的配體濃度足夠高，即滿足動力學(xué)調(diào)控的條件。這也可能是轉(zhuǎn)錄終止型重組核糖開關(guān)激活指數(shù)低于其他類型的原因之一。

3.3 原核生物與真核生物

核糖開關(guān)能否在哺乳細胞內(nèi)同樣發(fā)揮基因調(diào)控作用，是探索其在基因治療應(yīng)用前必須要回答的根本問題。迄今為止，幾乎所有的核糖開關(guān)均來自細菌等原核生物，TPP核糖開關(guān)是唯一在真菌和植物等真核生物內(nèi)發(fā)現(xiàn)的核糖開關(guān)，在哺乳細胞內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)天然核糖開關(guān)的存在。在生物從低等向高等的進化過程中，蛋白質(zhì)在基因調(diào)控方面似乎占據(jù)了上風(fēng)，低等生物中尚存的核糖開關(guān)被認為是基因調(diào)控的活化石。核糖開關(guān)功能發(fā)揮無需蛋白的參與，對于復(fù)雜的哺乳細胞來說，可能因核糖開關(guān)的作用機制過于簡單而將其淘汰。最近Kim等[28]設(shè)計的mRNA選擇性剪接核糖開關(guān)在Hela細胞內(nèi)可以調(diào)節(jié)mRNA的選擇性剪接，預(yù)示了其在哺乳細胞內(nèi)發(fā)揮基因表達轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的可能性。Endoh等[47]的研究則表明，轉(zhuǎn)錄調(diào)控型核糖開關(guān)與特定蛋白相互配合，也可以在哺乳細胞內(nèi)發(fā)揮基因調(diào)控作用，提示我們研究思路的適當(dāng)調(diào)整也許會產(chǎn)生出人意料的結(jié)果。

4 展望

構(gòu)建核糖開關(guān)的關(guān)鍵是建立高效的配體特異性的適體篩選平臺，獲得適體序列的核心區(qū)域；然后可根據(jù)表達調(diào)控區(qū)域的非保守性，結(jié)合不同的物種采用相應(yīng)的基因表達調(diào)控機制以實現(xiàn)靶基因的快速、高效和特異的調(diào)控，如原核生物多采用轉(zhuǎn)錄終止型和翻譯啟動型復(fù)雜核糖開關(guān)；真核生物則多采用 mRNA剪切調(diào)控型復(fù)雜核糖開關(guān)等。組合數(shù)學(xué)建模設(shè)計在優(yōu)化核糖開關(guān)序列，探索核糖開關(guān)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系方面也可以發(fā)揮重要作用[48]。在明確核糖開關(guān)作用機制的基礎(chǔ)上，依據(jù)生物信息學(xué)和構(gòu)效分析，可進一步設(shè)計通用型的核糖開關(guān)，用于不同組織和細胞內(nèi)靶基因表達調(diào)控；同時也可以設(shè)計組織特異性核糖開關(guān)，用于腫瘤等疾病的靶向治療。

核糖開關(guān)的發(fā)現(xiàn)再一次改變了人們對 RNA的固有觀念，近 10年的研究初步揭示了其作用機制的新穎性、多樣性及復(fù)雜性。通過適體域和表達平臺的拼接構(gòu)建可以在細胞內(nèi)發(fā)揮基因表達調(diào)控作用的重組核糖開關(guān)的研究思路，現(xiàn)在看來雖然可行，但距離成功應(yīng)用尚為時過早。天然核糖開關(guān)經(jīng)歷了數(shù)十億年的進化演變才得以實現(xiàn)，在對其機理的認識仍嫌淺薄的今天，試圖在實驗室內(nèi)用幾周時間就制備出性能卓越的核糖開關(guān)太過樂觀。但是隨著對其構(gòu)效關(guān)系及作用機理的深入了解，高通量自動化體內(nèi)篩選技術(shù)的建立和日益成熟，借助計算機輔助設(shè)計等新型手段，及時調(diào)整研究思路與方法，核糖開關(guān)這一“化石”級調(diào)控元件一定可以在基因治療的嶄新領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

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