王丹妹，何 佟，吉麗敏，翁 陽(yáng)，莫燕娜

(海南醫(yī)學(xué)院，?？?71101)

研究證明經(jīng)典的熱應(yīng)激預(yù)處理(42℃)可誘導(dǎo)熱休克蛋白(HSP)表達(dá)增加，對(duì)腸缺血—再灌注損傷(IR)有保護(hù)作用［1］。但其他溫度熱應(yīng)激預(yù)處理腸IR的影響尚不明確。2010年7月～2011年12月，我們觀(guān)察并比較了38.5～39℃、40～40.5℃、41.5～42℃全身熱應(yīng)激預(yù)處理后大鼠腸黏膜HSP水平、Caspase-3活性及腸黏膜細(xì)胞凋亡情況?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SD雄性大鼠50只，體質(zhì)量200～230 g，購(gòu)自于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)分為5個(gè)組。A組為正常體溫+假手術(shù)對(duì)照組，B組為正常體溫+腸IR組;C組為38.5～39℃熱應(yīng)激+腸IR組，D組為40～40.5℃熱應(yīng)激+腸IR組，E組為41.5～42℃熱應(yīng)激+腸IR組。

1.2 試劑與設(shè)備 鼠抗誘導(dǎo)型HSP70(HSP72) mAb(SPA-810)(美國(guó)Stressgen公司);鼠抗β-actin mAb(南京建成生物工程研究所提供);DAB顯色試劑(武漢博士得生物工程公司);細(xì)胞凋亡原位末端標(biāo)記法(TUNEL)試劑盒(購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);Caspase-3 Colorimetric Assay(購(gòu)自美國(guó)R＆D公司)。Stat Fax-2100型酶標(biāo)儀(美國(guó)AWARENESS);光學(xué)顯微鏡(日本Olympus)。

1.3 全身熱應(yīng)激預(yù)處理方法 大鼠用3%戊巴比妥鈉(1.5 mL/kg體質(zhì)量)腹腔注射麻醉。C組置于45℃恒溫水浴箱中，使其肛溫在20 min內(nèi)達(dá)到38.5～39℃，然后移至事先已經(jīng)調(diào)溫好的39℃水浴箱中并維持10 min;D組置于50℃恒溫水浴箱中，使肛溫20 min內(nèi)達(dá)到40～40.5℃，維持10 min;E組置于55℃恒溫箱中，使肛溫在20 min內(nèi)升至41.5～42℃，維持10 min，取出置室溫24 h;A組和B組不進(jìn)行熱應(yīng)激預(yù)處理。

1.4 大鼠腸缺血—再灌注損傷模型制作方法 大鼠預(yù)先禁食12 h，但可自由飲水。用3%戊巴比妥鈉(1.5 mL/kg體質(zhì)量)進(jìn)行腹腔注射麻醉。取正中切口，分離出腸系膜上動(dòng)脈(SMA)，室溫靜置10 min。B、C、D、E組用微動(dòng)脈夾夾閉系膜上動(dòng)脈，30 min后輕輕取出動(dòng)脈夾，自然恢復(fù)血液重新灌流。A組只分離但不夾閉SMA。

1.5 腸道組織形態(tài)學(xué)觀(guān)察方法 自然恢復(fù)血液再灌注60 min及相應(yīng)時(shí)點(diǎn)，從腸道回盲部近端距回盲瓣10 cm處剪取約2 cm長(zhǎng)度的小腸標(biāo)本，放入盛有中性甲醛溶液中固定，備以后做常規(guī)病理切片用，用HE染色方法進(jìn)行染色，觀(guān)察腸組織形態(tài)學(xué)變化。

1.6 腸黏膜HSP72水平、Caspase-3活性、細(xì)胞凋亡率檢測(cè)方法 從距回盲瓣12 cm處截取約3～4 cm長(zhǎng)度的小腸，置預(yù)冷的生理鹽水中，縱向剖開(kāi)，輕柔漂洗2～3次，然后刮取腸黏膜置于EP管中，放置－80℃冰箱貯存?zhèn)溆谩＂貶SP72水平。采用Western Blot法。提取腸黏膜蛋白，考馬斯亮藍(lán)(Bradford)法進(jìn)行蛋白定量。采用Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺(100 g/L)凝膠進(jìn)行電泳，電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，以20 g/L牛血清白蛋白封閉后，一抗封閉4 h以及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗封閉1 h，以β-actin作為內(nèi)對(duì)照，DAB顯色。采用Scion Image軟件進(jìn)行計(jì)算HSP72的灰度值與β-actin的灰度值，檢測(cè)各樣本中HSP72表達(dá)水平(即HSP72灰度值/β-actin灰度值)。②細(xì)胞凋亡率。采用原位末端缺口標(biāo)記法(TUNEL)。操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。在高倍顯微鏡下見(jiàn)胞核呈棕褐色的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞凋亡率 =凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù) ×100%。③Caspase-3活性。采用比色法。操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用Stat Fax-2100型酶標(biāo)儀讀取各孔吸光度值(波長(zhǎng)為405 nm)，計(jì)算出樣本的Caspase-3活性值(即樣本孔的吸光度值－對(duì)照孔的吸光度值)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件。結(jié)果以±s表示，組間比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腸道組織形態(tài)學(xué)變化 B組見(jiàn)有固有層破壞，出血;C組損傷程度比B組輕，見(jiàn)部分絨毛頂端破損;D、E組腸黏膜損傷程度更輕，僅出現(xiàn)絨毛頂端上皮下間隙增大或絨毛輕度水腫。

2.2 腸黏膜HSP72水平 A、B、C、D、E組大鼠腸黏膜組織HSP72水平分別為0.40±0.09、0.26± 0.09、1.08±0.11、1.39±0.23、2.72±0.88。C、D、E組腸黏膜組織HSP72水平高于A(yíng)、B組(P均＜0.05);E組腸黏膜組織HSP72水平明顯高于C、D組(P均＜0.05)。

2.3 腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡率 A、B、C、D、E組大鼠腸黏膜組織細(xì)胞凋亡率分別為4.60%±1.12%、35.53% ±3.40%、21.10% ±3.11%、7.50% ± 1.88%、6.60%±1.83%。腸黏膜細(xì)胞凋亡率D、E組比B組降低(P均＜0.05);C組與B組相比雖數(shù)值略有降低，但P＞0.05;D、E組相比，P＞0.05。

2.4 腸黏膜Caspase-3活性 A、B、C、D、E組大鼠腸黏膜組織 Caspase-3活性分別為1.22±0.14、2.72±0.55、1.33±0.24、1.41±0.30、1.16±0.30。C、D、E組大鼠腸黏膜組織Caspase-3活性與B組相比明顯降低(P均＜0.05)，D組與E組、D組與A組、E組與A組相比，P均＞0.05。

3 討論

從最簡(jiǎn)單的原核生物到復(fù)雜的生物體乃至人類(lèi)，各種應(yīng)激因素都會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)保護(hù)性分子HSP的表達(dá)增加［2，3］。目前的研究表明，HSP是一組非特異性細(xì)胞保護(hù)蛋白，具有多種功能。因應(yīng)激誘導(dǎo)機(jī)體表達(dá)熱休克蛋白，可以耐受其他不利因素對(duì)機(jī)體細(xì)胞的損傷［4］。誘導(dǎo)型HSP(HSP72)可以作為應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志，是HSP中最受關(guān)注的一種［5］。

本研究中我們用不同溫度(39、40、42℃)對(duì)大鼠進(jìn)行不同強(qiáng)度的全身熱應(yīng)激處理，檢測(cè)腸黏膜HSP72的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同強(qiáng)度熱應(yīng)激處理，均能誘導(dǎo)HSP72蛋白表達(dá)水平增加，在3個(gè)溫度范圍內(nèi)，呈現(xiàn)隨著處理溫度的升高腸黏膜HSP72蛋白表達(dá)水平增加的線(xiàn)性改變，以E組最顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與在人A549肺內(nèi)皮細(xì)胞中的觀(guān)察結(jié)果一致［6］。

腸IR是臨床常見(jiàn)的各種組織器官損傷之一，在腸移植、嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、應(yīng)激等疾患的病理演變過(guò)程中起重要作用［7］。目前認(rèn)為腸IR與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［8］。本研究中筆者通過(guò)夾閉—松開(kāi)腸系膜上動(dòng)脈的方法復(fù)制腸IR模型，結(jié)果顯示IR組腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡率和Caspase-3活性值顯著增高，說(shuō)明成功建立了腸IR模型。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)全身熱應(yīng)激處理的大鼠在IR后腸黏膜形態(tài)學(xué)的改變較未經(jīng)熱處理組有不同程度的減輕，腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)和腸黏膜細(xì)胞Caspase-3活性也呈現(xiàn)不同程度的下降，以D、E組改善明顯。表明不同強(qiáng)度的全身熱應(yīng)激處理對(duì)腸IR均有保護(hù)作用，這種保護(hù)效應(yīng)與熱應(yīng)激誘導(dǎo)HSP72蛋白的表達(dá)水平有關(guān)。與以往的研究結(jié)果［7］一致。以往的研究認(rèn)為可誘導(dǎo)性HSP的表達(dá)增加可增強(qiáng)細(xì)胞抗凋亡作用［10］。HSP70能抑制通過(guò)Fas傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)的Caspase-3、8的活化而防止細(xì)胞凋亡［11］。HSP72的保護(hù)效應(yīng)體現(xiàn)在對(duì)凋亡上游通路的阻斷［12～15］。此外本研究結(jié)果顯示，D、E組大鼠腸黏膜形態(tài)學(xué)、細(xì)胞凋亡率和Caspase-3活性差異不大，這是否提示腸黏膜HSP72的表達(dá)達(dá)到一定水平即達(dá)到最大的保護(hù)效應(yīng)，其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究闡明。

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