吳劍宏，阮狄克，王德利，張 超，何 勍，王超鋒，張 燕，辛洪奎，顧 韜，徐 成，劉 玥

近年來(lái)，基因治療成為椎間盤退變性疾病生物學(xué)治療的研究熱點(diǎn)。隨著對(duì)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)基因研究的深入，通過(guò)載體將TERT基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞，進(jìn)而激活細(xì)胞端粒酶活性，使細(xì)胞延長(zhǎng)壽命，甚至使細(xì)胞“永生化”成為可能［1-2］。腺相關(guān)病毒是目前在基因治療研究領(lǐng)域常使用的一種病毒類載體［3］，本研究使用腺相關(guān)病毒為載體介導(dǎo)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)基因轉(zhuǎn)染人椎間盤髓核細(xì)胞，評(píng)估重組腺相關(guān)病毒人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(recombinant adeno-associated virus vector-mediated hTERT gene，rAAV-hTERT)是否能轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)人髓核細(xì)胞，并對(duì)其安全性相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，為進(jìn)一步的功能研究及在體研究提供安全性證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

DMEM培養(yǎng)液、PBS液(Hyclone)、胎牛血清(fetal bovineserum，F(xiàn)BS)(Gibco)，0.25%Trypsin-EDTA(Gibco)，trizol液(Invitrogen)，Ⅱ型膠原酶(碧云天)，鼠抗人hTERT蛋白單抗及羊抗兔/鼠二抗(Abcam)。PCR、RT-PCR 試劑盒(Promega)，75 μm的細(xì)胞濾膜(Millipore)，6孔培養(yǎng)板(corning)，PCR引物根據(jù)PCR引物設(shè)計(jì)原則，按照hTERT及甘油醛-3-磷酸 脫 氫 酶 (glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)基因序列，利用 Prime Premer 5軟件設(shè)計(jì)，由北京博邁德生物公司合成。3～4周齡裸鼠由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心提供。rAAV-hTERT(病毒滴度=1×1012μg/mL)由北京五加和生物技術(shù)公司包裝。Hela細(xì)胞由解放軍307醫(yī)院婦產(chǎn)科實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 人椎間盤髓核細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

椎間盤髓核標(biāo)本來(lái)源于1名19歲男性的正常椎間盤髓核組織，將標(biāo)本用PBS清洗2次后仔細(xì)分離出髓核組織，將髓核組織修剪成1 mm3大小的組織塊，0.025% Ⅱ型膠原酶置于 37°C、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化14～16 h，將消化液用75 μm的細(xì)胞濾膜過(guò)濾，收集細(xì)胞以1×105/孔的密度培養(yǎng)于6孔培養(yǎng)板，以含10%FBS的DMEM為培養(yǎng)液，置于37°C含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，2～3 d換液1次，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2.2 rAAV-hTERT轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)人髓核細(xì)胞

轉(zhuǎn)染培養(yǎng)傳代后的第2代人髓核細(xì)胞(70%～80%融合時(shí))，計(jì)數(shù)細(xì)胞，用PBS清洗細(xì)胞2次，按推薦的感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)每細(xì)胞105v.g 加入病毒轉(zhuǎn)染液 2 mL，置于 37°C、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，棄去病毒轉(zhuǎn)染液，無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基清洗2次，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)傳代，于不同的時(shí)間點(diǎn)取出部分細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)共分3組:①rAAV-hTERT轉(zhuǎn)染組;②AAV空病毒轉(zhuǎn)染組;③未轉(zhuǎn)染組。

1.2.3 rAAV-hTERT轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)(RTPCR)

用半定量的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)的方法來(lái)檢測(cè)hTERT基因及GAPDH基因(內(nèi)參照)在mRNA水平上的表達(dá)情況，在轉(zhuǎn)染后的7 d、90 d、120 d、150 d各取6孔rAAV-hTERT轉(zhuǎn)染組、AAV空病毒轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組髓核細(xì)胞，將各組細(xì)胞各自混勻后用trizol法提取各組 RNA，然后利用 AMV random dT primer和AMV在42°C條件下孵育1 h，將 RNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，以cDNA為模板在 PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件如下:95°C、5 min，94℃、45 s，56℃、45 s，72℃、45 s，33 個(gè)循環(huán);72℃10 min。GAPDH上游引物:5’-GAA GGT CGG AGT CAA CGG-3’;GAPDH下游引物:5’-GGA AGA TGG TGA TGG GAT T-3’;hTERT基因上游引物:5’-GCC AGC ATC ATC AAA CCC-3’;hTERT基因下游引物:5’-CCA CGA ACT GTC GCA TGT AC-3’，PCR 產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 rAAV-HTERT轉(zhuǎn)染后蛋白水平表達(dá)的檢測(cè)(western-blot)

在轉(zhuǎn)染后的 7 d、90 d、120 d、150 d 各取 6 孔rAAV-hTERT轉(zhuǎn)染組、AAV空病毒轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組髓核細(xì)胞，以冷PBS洗滌3次后加入預(yù)冷的細(xì)胞裂 解 液 (1% NP-40，20 mmol/L Tris pH 7.4，150 mmol/L NaCl，10% 甘油，1 mmol/L苯甲基磺酰氟，10 mL抑菌肽，1 g/mL亮肽素，500 mmol/L正礬酸鈉)，混勻，置于冰上 30 min，4℃、12000 ×g離心20 min，收集上清，BioRad法蛋白定量后調(diào)整蛋白濃度一致。加等量的2×SDS上樣緩沖液，94℃變性10 min，配制150 L的聚丙烯酰胺分離膠，每孔上樣60 g蛋白，電泳分離蛋白后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%的脫脂牛奶封閉1 h后各樣品用8%SDS-PAGE電泳分離，之后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。轉(zhuǎn)移好的硝酸纖維素膜用5%脫脂奶粉+TBS 37℃封閉1 h，鼠抗人hTERT蛋白單抗(1∶1000，Abcam)4℃ 孵育過(guò)夜，TBS/0.1%Tween-20洗滌3次后加人辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔/鼠(1∶2000，Abcam)，37℃ 孵育1 h，TBS/0.1%Tween-20洗膜后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的條帶的表達(dá)。圖像掃描進(jìn)行Western blot免疫印跡分析。另配置120 g/L的分離膠，按傳統(tǒng)方法做內(nèi)參GAPDH的Western blot免疫印跡。

1.2.5 髓核細(xì)胞染色體核型分析

取rAAV-hTERT轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)10代(120 d)細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染組2代髓核細(xì)胞培養(yǎng)于60 mL培養(yǎng)瓶中，以含10%FBS的DMEM為培養(yǎng)液，置于37°C、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，隔日換液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底90% ～100%時(shí)，加入秋水仙素，終濃度為0.4 mg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后常規(guī)收獲、制片，G顯帶后進(jìn)行核型分析并顯微照相。

1.2.6 髓核細(xì)胞裸鼠致瘤性分析

取3組體外傳代7 d的髓核細(xì)胞及Hela細(xì)胞消化、離心，將細(xì)胞濃度調(diào)為3×107/mL，各取100 μL細(xì)胞懸腋注入5周齡裸鼠腋下，接種完畢后，置恒溫、恒濕的無(wú)菌凈化屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)，接種后3個(gè)月處死裸鼠，記錄腫瘤生長(zhǎng)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有測(cè)量數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，對(duì)灰度值變化比較采用單因素方差分析，對(duì)染色體異常比率行卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

各組細(xì)胞在單層培養(yǎng)條件下共培養(yǎng)14代(＞150 d)，倒置顯微鏡觀察顯示病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞無(wú)明顯差異，各組細(xì)胞在5代以前形態(tài)以多角形及長(zhǎng)梭形為主，隨著傳代次數(shù)的增加，長(zhǎng)梭形細(xì)胞比例逐漸增加，至培養(yǎng)14代(150 d)時(shí)，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)為一致的長(zhǎng)梭形。

2.2 hTERT基因mRNA及蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

RT-PCR(見(jiàn)圖1a)及Western-blot(見(jiàn)圖1b)檢測(cè)結(jié)果顯示了一致性:3組細(xì)胞均檢測(cè)到內(nèi)參條帶(GAPDH，220bp)，rAAV-hTERT轉(zhuǎn)染組在轉(zhuǎn)染后的7 d，90 d，120 d均可檢測(cè)到hTERT基因的表達(dá)，在轉(zhuǎn)染后150d未能檢測(cè)到hTERT基因表達(dá);另外2組則始終未檢測(cè)到hTERT基因的表達(dá)。通過(guò)對(duì)PCR及Western-blot條帶灰度值的比較分析(見(jiàn)圖1c)，轉(zhuǎn)染后第7天hTERT基因mRNA表達(dá)的相對(duì)水平是最高的，而隨著細(xì)胞傳代次數(shù)及時(shí)間的增加，hTERT基因mRNA表達(dá)的相對(duì)水平逐漸降低。

圖1 hTERT基因的表達(dá)Fig.1 The levels of mRNA and protein expression for hTERT

2.3 髓核細(xì)胞染色體核型分析結(jié)果

體外培養(yǎng)2代(14 d)未轉(zhuǎn)染組中期髓核細(xì)胞分裂數(shù)為50個(gè)，10代(120 d)轉(zhuǎn)染rAAV-hTERT組中期髓核細(xì)胞分裂數(shù)為75個(gè)(見(jiàn)表1)，結(jié)果顯示細(xì)胞為男性染色體核型，染色體總數(shù)為46條，可見(jiàn)部分染色體丟失(亞二倍體)，G-帶核型分析未見(jiàn)染色體結(jié)構(gòu)異常克隆，基本核型為男性正常核型(46，XY;見(jiàn)圖2)。

2.4 裸鼠致瘤性結(jié)果

細(xì)胞接種1周左右形成肉眼可見(jiàn)腫瘤，3個(gè)月后3組細(xì)胞均未觀察到裸鼠腋下腫瘤生長(zhǎng)，而Hela細(xì)胞接種組可見(jiàn)明顯的腫瘤形成，大小約3 cm×2 cm×2 cm(見(jiàn)圖3)。

表1 髓核細(xì)胞染色體核型分析結(jié)果Tab.1 The results of the karyotypic analysis

圖2 髓核細(xì)胞染色體核型分析代表圖Fig.2 Karyotype analysis of rAAV-hTERT transfected HNP cells

圖3 裸鼠致瘤性結(jié)果圖Fig.3 The results of the oncogenicity in nude mice

3 討 論

椎間盤的退變是受年齡、機(jī)械物理、細(xì)胞、基因以及生化因子等多種因素影響的復(fù)雜的病理生理改變［4-5］。目前的各種手術(shù)及非手術(shù)治療手段僅僅是針對(duì)椎間盤退變引起的各種臨床癥狀的治療，而不是從恢復(fù)椎間盤細(xì)胞功能的角度上去逆轉(zhuǎn)椎間盤的退變。生物學(xué)治療由于具有延緩甚至逆轉(zhuǎn)椎間盤退變的潛能，而成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)［6］。在生物學(xué)治療策略中，種子細(xì)胞的選擇是一個(gè)非常關(guān)鍵的問(wèn)題。近年來(lái)，在椎間盤退變性疾病種子細(xì)胞選擇的研究上有很多進(jìn)展［7-8］，可供選擇的種子細(xì)胞也很多，如脂肪干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及軟骨細(xì)胞等，雖然均能達(dá)到生物學(xué)治療的部分目的，但也存在著一些缺點(diǎn)和不足:①干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的條件難以穩(wěn)定掌握;②誘導(dǎo)分化的類髓核細(xì)胞的功能穩(wěn)定性難以長(zhǎng)期維持;③軟骨細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)成分與髓核組織在量上有著明顯的區(qū)別［9］。因而，盡管這些細(xì)胞都能在某種程度上部分恢復(fù)髓核的細(xì)胞外基質(zhì)含量，但其畢竟不是真正意義上的髓核細(xì)胞。

因而，研究者又回過(guò)頭來(lái)繼續(xù)對(duì)髓核組織來(lái)源細(xì)胞加以研究，期望通過(guò)挖掘髓核細(xì)胞本身的未知潛能，使其作為生物學(xué)治療的種子細(xì)胞來(lái)源。理論上，自體組織來(lái)源的細(xì)胞是最佳的種子細(xì)胞，然而髓核細(xì)胞來(lái)源有限，在長(zhǎng)期的體外培養(yǎng)過(guò)程中容易發(fā)生細(xì)胞的去分化現(xiàn)象。隨著對(duì)人類端粒酶基因的研究深入，通過(guò)將hTERT基因功能片段轉(zhuǎn)入成體細(xì)胞，從而激活細(xì)胞端粒酶活性，進(jìn)而維持端粒長(zhǎng)度以幫助細(xì)胞逃過(guò)衰老過(guò)程，成為延長(zhǎng)細(xì)胞壽命的一種良好方法。迄今為止，學(xué)者們已經(jīng)利用hTERT基因在19種不同組織的35種細(xì)胞上進(jìn)行了驗(yàn)證，證實(shí)hTERT基因能夠延長(zhǎng)細(xì)胞的生命，維持細(xì)胞的功能［10］。這一轉(zhuǎn)基因策略同樣也為延長(zhǎng)體外培養(yǎng)髓核細(xì)胞壽命提供了可能。一個(gè)高效的基因治療載體是基因治療成功的關(guān)鍵，AAV是目前在基因治療領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛的一個(gè)病毒類載體，AAV擁有較多的優(yōu)勢(shì):①低致病性，低免疫原性，安全性好，迄今為止尚未在人類和哺乳動(dòng)物身上發(fā)現(xiàn)和AAV相關(guān)的疾?。?1-12］;②表達(dá)時(shí)間長(zhǎng);③轉(zhuǎn)染效率較高，能轉(zhuǎn)染分裂期和非分裂期細(xì)胞［13-14］。

對(duì)于椎間盤退變這種慢性疾病來(lái)說(shuō)，需要轉(zhuǎn)基因能在髓核細(xì)胞內(nèi)獲得一個(gè)長(zhǎng)期、安全、高效的表達(dá)，這也是選擇AAV作為基因治療載體的主要原因。然而，在驗(yàn)證rAAV-hTERT基因轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞是否有應(yīng)用價(jià)值之前，尚需進(jìn)行2步關(guān)鍵性的基礎(chǔ)工作:①必須在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)髓核組織對(duì)目的基因轉(zhuǎn)染是易感的;②hTERT基因轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞是安全的。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)AAV載體將hTERT基因?qū)塍w外培養(yǎng)人椎間盤髓核細(xì)胞，并證實(shí)導(dǎo)入的hTERT基因能在髓核細(xì)胞內(nèi)正確的表達(dá)，持續(xù)表達(dá)時(shí)間 ＞120 d。

正常人的體細(xì)胞染色體數(shù)目為46條，并有一定的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。染色體在形態(tài)結(jié)構(gòu)或數(shù)量上的異常被稱為染色體異常。染色體核型分析是細(xì)胞遺傳學(xué)研究的基本方法，是研究物種演化、分類以及染色體結(jié)構(gòu)、形態(tài)與功能之間的關(guān)系所不可缺少的重要手段。經(jīng)核型分析后，可根據(jù)染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的變異來(lái)判斷生物的病因，比如是由于缺少了什么樣的基因才導(dǎo)致的這種疾?。?5］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示rAAV-hTERT轉(zhuǎn)染后10代髓核細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染2代髓核細(xì)胞均有一定比例的染色體結(jié)構(gòu)異常，但2組細(xì)胞異常率差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，未出現(xiàn)多倍體及染色體異常結(jié)構(gòu)的克隆;由于并非固定部位的克隆，所以染色體數(shù)目的減少更可能是實(shí)驗(yàn)操作的原因，而非異常結(jié)構(gòu)克隆，顯示在遺傳水平細(xì)胞未發(fā)生突變，不具致瘤性。

裸鼠體內(nèi)致瘤性也是檢驗(yàn)細(xì)胞致瘤性的一項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)［16］，裸鼠為人工去胸腺培育動(dòng)物，其自身排斥反應(yīng)較小，目前已廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)研究中。本研究所選用的Hela細(xì)胞為宮頸癌細(xì)胞［17-19］，較之于其他來(lái)源腫瘤細(xì)胞，其特點(diǎn)為增殖異常迅速，從1951年發(fā)現(xiàn)至今，已培養(yǎng)了50多年，號(hào)稱“不死”細(xì)胞，目前已廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)相關(guān)疾病的研究中。本研究選擇Hela細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照組，對(duì)其進(jìn)行裸鼠體內(nèi)移植研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Hela細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)裸鼠中種植后1周左右形成肉眼可見(jiàn)腫瘤，而另外3組細(xì)胞在移植3個(gè)月后均未觀察到裸鼠腋下腫瘤生長(zhǎng)，提示rAAV-hTERT轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞在有限的體外培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)不具有致瘤性，但其更長(zhǎng)期的致瘤性還有待于進(jìn)一步的觀察研究。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示通過(guò)體外構(gòu)建的rAAV-hTERT能成功轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)人髓核細(xì)胞并正確表達(dá)，通過(guò)對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞的染色體核型分析及裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)顯示，rAAV-hTERT轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞體外長(zhǎng)期培養(yǎng)后未出現(xiàn)基因水平的突變，不具有裸鼠致瘤性，證實(shí)在體外培養(yǎng)一定時(shí)間內(nèi)rAAV-hTERT轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞是安全的，為進(jìn)一步的rAAV-hTERT轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞的功能研究及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供了安全性證據(jù)。

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