王洪海，張成博，韓 濤，楊海燕，于學(xué)美

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南250355；2.泰山醫(yī)學(xué)院，山東泰安271016）

酒精性脂肪肝是酒精性肝病最早的病理改變之一，也是飲酒所致的最常見的肝臟病變。與其他類型脂肪肝相比，酒精性脂肪肝發(fā)生肝纖維化和肝硬化的進(jìn)程相對(duì)較快，發(fā)病率相對(duì)較高。早期治療酒精性脂肪肝可以降低酒精性肝硬化的發(fā)病率，中醫(yī)通過辨證施治具有獨(dú)特的療效。我們用臨床治療經(jīng)驗(yàn)方芪龍益肝方藥作用于酒精性脂肪肝大鼠，檢測(cè)其對(duì)模型大鼠肝組織細(xì)胞色素CYP2E1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠50只，體重（180±20）g。由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（SCXK魯20050004）。

1.1.2 主要試劑和儀器 HP2AS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)，CYP2E1多抗購(gòu)自美國(guó)CHEMICON公司（批號(hào)：20050603）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠酒精性脂肪肝模型建立 雄性Wistar大鼠50只，隨機(jī)取10只作為正常對(duì)照組正常飼養(yǎng)，其余動(dòng)物按照文獻(xiàn)方法［1-3］造模，給予基礎(chǔ)飼料加1%膽固醇、5%豬油、10%玉米油做成的混合飼料，另外按白酒劑量5 g/kg·次灌胃，以后每10 d根據(jù)大鼠體重、活動(dòng)及反應(yīng)情況增加灌酒量 1 g，最終白酒灌胃劑量達(dá)8 g/kg·次［4］。飼養(yǎng)8 w后，空白對(duì)照組、模型組隨機(jī)各取5只采血測(cè)定CHO、TG、HDL、ALT、AST，活殺做病理組織學(xué)檢查確定是否已形成酒精性脂肪肝模型。

1.2.2 分組及給藥 隨機(jī)將酒精性脂肪肝模型大鼠分為模型對(duì)照組、護(hù)肝片組、聯(lián)苯雙酯組、全方組。芪龍益肝方藥由山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制劑中心提供，全方成人日用量為117 g，按體表面積比值折算，給予大鼠中劑量10.3 g/kg。護(hù)肝片由黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：200408004。人日用量為12片，按體表面積折算，護(hù)肝片組大鼠給藥中劑量為1.08片/kg。聯(lián)苯雙酯滴丸由德州德藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：040415。按體表面積折算，聯(lián)苯雙酯組大鼠給藥的中劑量為4.05 mg/kg。以上藥物按1 mL/100 g體重的體積每日早上8時(shí)灌胃給藥，連續(xù)30 d。正常對(duì)照組、模型對(duì)照組灌胃等量生理鹽水。除正常對(duì)照組外，其他各組繼續(xù)給予高脂飼料喂食，同時(shí)給予含乙醇10%的日常飲用水。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠酒精性脂肪肝模型建立

結(jié)果見表1，圖1。

表1 大鼠酒精性脂肪肝模型檢測(cè) （mmol/L，±s）

表1 大鼠酒精性脂肪肝模型檢測(cè) （mmol/L，±s）

注：與正常對(duì)照組比較，1）P<0.001，2）P<0.05

組別 T G C H O H D L A L T A S T正常對(duì)照組 0.75±0.14 1.16±0.33 1.09±0.15 46.75±8.2492.25±5.56模型組 2.25±0.40 1） 2.30±0.38 2） 0.76±0.14 1） 81.5±8.13 1） 174.75±10.27 1）

由表1可以看出，模型組 TG、CHO、ALT、AST明顯增高，HDL下降，與正常對(duì)照組相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示模型成立。

圖1 成模檢測(cè)兩組大鼠肝組織病理切片（HE染色）

由圖1可以看出，正常對(duì)照組肝細(xì)胞大小一致，排列整齊，核無(wú)畸形，無(wú)明顯變性、壞死和纖維化。模型對(duì)照組肝細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)內(nèi)有大量脂肪空泡，細(xì)胞核變小，并且偏位。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組出現(xiàn)明顯的脂肪變性。

2.2 芪龍益肝方對(duì)肝組織細(xì)胞色素CYP2E1表達(dá)的影響

末次給藥后24 h，處死取各組大鼠肝組織，經(jīng)10%中性福爾馬林充分固定，常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋，連續(xù)4 μm切片，作細(xì)胞色素p-4502E1（CYP2E1）染色。采用SABC法，切片脫蠟水化后經(jīng)微波抗原修復(fù)，血清封閉，滴加1∶200兔抗鼠P-4502E1多抗。4℃冰箱過夜，DAB顯色。染色過程中作陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照以PBS緩沖液替代一抗。將P-4502E1免疫組織化學(xué)染色切片在10倍的物鏡下，選擇陽(yáng)性細(xì)胞較多的區(qū)域采集3～5個(gè)光鏡視野，輸入HP2AS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)。統(tǒng)一背底和倍體，對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞占所有細(xì)胞的百分比均值進(jìn)行計(jì)算機(jī)定量分析。結(jié)果表明，酒精性脂肪肝時(shí)CYP2E1表達(dá)增強(qiáng)。給予芪龍益肝方后CYP2E1表達(dá)減少，與護(hù)肝片組和聯(lián)苯雙酯組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見表2。

表2 芪龍益肝方對(duì)肝組織細(xì)胞色素CYP2E1表達(dá)的影響 （±s）

表2 芪龍益肝方對(duì)肝組織細(xì)胞色素CYP2E1表達(dá)的影響 （±s）

注：與模型對(duì)照組比較，1）P<0.001；與正常對(duì)照組比較，2）P<0.01，3）P<0.05；與護(hù)肝片組比較，4）P<0.05；與聯(lián)苯雙酯組比較，5）P<0.05

組別 C Y P 2 E 1表達(dá)正常對(duì)照組 0.031±0.01模型對(duì)照組 0.380±0.14 2）全方組 0.080±0.05 1）4）5）拆方組 0.150±0.07 1）3）護(hù)肝片組 0.170±0.05 1）聯(lián)苯雙酯組 0.180±0.10 1）

3 討論

芪龍益肝方就是在肝氣虛損、酒毒損傷的理論基礎(chǔ)上組方，本方由生黃芪、穿山龍、玫瑰花、葛根、白術(shù)、青皮等藥物組成。生黃芪甘溫，入肺、脾經(jīng)。功能補(bǔ)氣，兼能升氣?！夺t(yī)學(xué)衷中參西錄》載“肝屬木而應(yīng)春氣，其氣溫而性喜條達(dá)，黃芪之性溫而上升，以之補(bǔ)肝緣同氣相求之妙用”?，F(xiàn)代藥理研究證明黃芪具有保肝、抗氧化、抗肝纖維化、降脂的作用。穿山龍活血逐瘀，具有降低膽固醇、抗炎鎮(zhèn)痛功效。葛根輕清升散，能升發(fā)脾之清氣，鼓舞胃氣上行。脾胃是氣機(jī)升降之樞紐，能升清降濁，清陽(yáng)升則濁陰自降，用葛根以升發(fā)清陽(yáng)、解酒毒。白術(shù)健脾燥濕，以助脾運(yùn)，培土榮木以加強(qiáng)黃芪補(bǔ)肝氣之力，現(xiàn)代藥理表明白術(shù)具有保肝、降酶、利膽、抗氧化、改善免疫的作用。玫瑰花理氣解郁、和血散瘀，玫瑰花、穿山龍兩藥皆氣味芳香，有化濁之功，以通肝絡(luò)解疼痛。青皮苦辛性溫，入肝、膽經(jīng)。本品沉降下行，能疏肝行氣，善理肝膽之滯氣，尤善除痞散結(jié)、消積化滯。用其直入肝經(jīng)，疏肝破氣以消除積滯。諸藥合用，共收補(bǔ)益肝氣、化濁通絡(luò)之功。

細(xì)胞色素P-450系統(tǒng)是位于滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一組混合功能氧化酶系，它參與內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)代謝，細(xì)胞色素P-4502E1（CYP2E1）是該系統(tǒng)的主要組成部分，CYP2E1是機(jī)體攝入藥物和毒物（四氯化碳、乙醇、脂肪酸）的主要代謝酶。從解毒功能的角度來(lái)看，CYP2E1比其他同工酶更為重要［5］。CYP2E1在酒精性肝病的發(fā)病機(jī)制中主要參與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，與氧自由基和羥自由基的生成有關(guān)。酒精在肝細(xì)胞內(nèi)通過細(xì)胞色素P4502E1并在鐵離子參與下的氧化作用，會(huì)產(chǎn)生過多的氧應(yīng)激產(chǎn)物，如羥自由基、超氧陰離子、過氧化氫等自由基，這些自由基可激活磷脂酶及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低膜磷脂，改變其通透性和流動(dòng)性，從而改變與膜結(jié)合的酶、受體和離子通道的微環(huán)境，影響其功能；還可以刺激肝星狀細(xì)胞分泌膠原，最終導(dǎo)致肝纖維化的產(chǎn)生［6］。CYP2E1隨脂肪肝程度的加重，表達(dá)逐漸增高［7］。酒精性脂肪肝時(shí)CYP2E1表達(dá)增強(qiáng)。正常肝組織內(nèi)，CYP2E1表達(dá)僅見于中央靜脈區(qū)，主要表達(dá)于肝腺泡Ⅲ區(qū)，在乙醇、藥物或其他毒物的作用下Ⅰ區(qū)或Ⅱ區(qū)CYP2E1表達(dá)。給予芪龍益肝方后CYP2E1表達(dá)減少，與護(hù)肝片組和聯(lián)苯雙酯組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。抑制CYP2E1在Ⅰ區(qū)或Ⅱ區(qū)的表達(dá)可能是芪龍益肝方治療酒精性脂肪肝的作用機(jī)制之一。

［1］厲有名，夏維新.脂肪肝現(xiàn)代診療［M］.南京：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，2003：65.

［2］于學(xué)美，韓濤，崔西泉，等.補(bǔ)益肝氣方藥對(duì)酒精性脂肪肝模型大鼠 TNF-α 含量的影響［J］.泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，28（11）：841.

［3］于學(xué)美，韓濤，張成博，等.補(bǔ)益肝氣方藥對(duì)酒精性脂肪肝模型大鼠的治療效應(yīng)［J］.泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，28（4）：241.

［4］孫怡寧，尚榮軍.白酒灌胃法建立大鼠早期酒精性肝病模型［J］.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2002，32（6）：565.

［5］戴軍，陸倫根，曾民德.肝細(xì)胞色素P-4502E1在實(shí)驗(yàn)性肝纖維化組織中的表達(dá)［J］.肝臟，2000，5（1）：16.

［6］戴寧，曾民德,彭延申.復(fù)方中藥對(duì)酒精性脂肪肝肝細(xì)胞色素P4502E1 表達(dá)的影響［J］.中華肝臟病雜志，2003，11（11）：658.

［7］史洪濤，陳東風(fēng)，熊仁平.肝細(xì)胞色素P-4501A1、2E1在非酒精性脂肪肝發(fā)病中的作用［J］.中華消化雜志，2004，24（6）：360.