張 璐辛 陽(yáng)趙 陽(yáng)李 軍

（1 中國(guó)刑警學(xué)院 遼寧 沈陽(yáng) 110035；2 沈陽(yáng)市公安局皇姑分局 遼寧 沈陽(yáng) 110036）

16BT試劑盒在DNA檢驗(yàn)鑒定中的應(yīng)用

張 璐1辛 陽(yáng)1趙 陽(yáng)2李 軍1

（1 中國(guó)刑警學(xué)院 遼寧 沈陽(yáng) 110035；2 沈陽(yáng)市公安局皇姑分局 遼寧 沈陽(yáng) 110036）

采用16BT試劑盒多個(gè)熒光標(biāo)記STR位點(diǎn)及ABO基因位點(diǎn)復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)鑒定，取得滿(mǎn)意效果。說(shuō)明該試劑盒靈敏度較高，可靠性好，符合目前實(shí)際辦案的需要。

熒光標(biāo)記 STR 復(fù)合擴(kuò)增 ABO基因

ABO血型系統(tǒng)是人類(lèi)發(fā)現(xiàn)最早的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，1900年Landerstainer發(fā)現(xiàn)ABO血型系統(tǒng)后，立即被迅速地應(yīng)用于輸血醫(yī)學(xué)等臨床醫(yī)學(xué)研究和實(shí)踐中。隨著對(duì)ABO血型系統(tǒng)研究的深入，新的研究成果很快被推廣至人類(lèi)學(xué)、親緣關(guān)系分析及法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別等多種領(lǐng)域，并占有舉足輕重的地位，很長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)血型系統(tǒng)一直是法醫(yī)物證鑒定中所應(yīng)用的最主要的遺傳標(biāo)記。

傳統(tǒng)的法醫(yī)物證ABO血型檢測(cè)的目標(biāo)是紅細(xì)胞膜表面ABH抗原物質(zhì)，即糖脂或糖蛋白，檢驗(yàn)方法主要是采用諸如吸收實(shí)驗(yàn)、解離實(shí)驗(yàn)、混合凝集實(shí)驗(yàn)、酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)等血清學(xué)方法。血清學(xué)方法只能判定ABO血型的表現(xiàn)型，而且血清學(xué)的結(jié)果判定可能因?yàn)橥饨鐥l件對(duì)抗原活性的破壞、細(xì)菌污染、個(gè)體分泌狀態(tài)、個(gè)體發(fā)育狀態(tài)甚至可能受到機(jī)體所患疾病的影響，而導(dǎo)致判型失敗或判型錯(cuò)誤的結(jié)果發(fā)生。

1990年后，Yamamoto等通過(guò)對(duì)ABO基因的分析發(fā)現(xiàn)了各等位基因的核苷酸序列差異，為人們從分子水平進(jìn)行ABO基因分型打下基礎(chǔ)。尤其是隨著PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用，世界各地的學(xué)者開(kāi)展了大量的ABO血型基因分型的研究工作，并報(bào)道了一系列的檢驗(yàn)方法。這些方法包括PCR-RFLP、PCR直接測(cè)序和序列特異性引物擴(kuò)增（PCR-SSP）等方法，其中由于PCR-SSP方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度較快并且判型準(zhǔn)確，是研究最多和應(yīng)用最廣泛的一種。16BT試劑盒即是采用PCR－SSP的原理對(duì)多個(gè)熒光標(biāo)記STR位點(diǎn)及ABO基因位點(diǎn)復(fù)合擴(kuò)增進(jìn)行檢驗(yàn)鑒定。

1 材料與方法

142份精斑檢材均取自本檢驗(yàn)室受理的全國(guó)各地強(qiáng)奸及強(qiáng)奸殺人案例樣本。

1.1 DNA提取

所有檢材均按GA/T 383-2002 Chelex法提取DNA。

1.2 PCR擴(kuò)增

聯(lián)合應(yīng)用AB公司的Identifiler試劑盒和基點(diǎn)公司的16BT試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)17個(gè)STR基因座：D3S1358、vWA、FGA、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、D8S1179、CSF1PO、D2S1338、D19S433、TH01、TPOX、PentaE、PentaD。PCR反應(yīng)在PE-9700擴(kuò)增儀上進(jìn)行，PCR擴(kuò)增體系和循環(huán)條件按操作手冊(cè)完成。

1.3 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)AB-3130型DNA遺傳分析儀電泳分離和激光掃描分析，用Run 3130 Data Collection v3.0軟件收集電泳信息，Genemapper ID v3.2軟件分析擴(kuò)增片段大小，得到STR分型結(jié)果(如圖1，圖2)。

2 結(jié)果

142份精斑檢材中，AO基因型38例，占26.76%；AA基因型6例，占4.23%；BO基因型30例，占21.13%；BB基因型8例，占5.63%；AB基因型26例，占18.31%；OO基因型34例，占23.94%。

所有檢材兩個(gè)試劑盒共同的13個(gè)基礎(chǔ)位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果完全相同。

圖1 20號(hào)檢材Identifiler試劑盒檢測(cè)結(jié)果

圖2 20號(hào)檢材16BT試劑盒檢測(cè)結(jié)果

3 討論

基因擴(kuò)增方法檢測(cè)血型與傳統(tǒng)方法檢測(cè)血型比較,檢測(cè)的目標(biāo)是DNA，檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。傳統(tǒng)血清學(xué)檢驗(yàn)的細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)抗原，其決定因素也是DNA，因此對(duì)DNA檢測(cè)更準(zhǔn)確，而且基因分型更多。另外，DNA與蛋白質(zhì)相比，對(duì)于各種外界條件的影響和破壞具有更好的耐受性，因此針對(duì)微量、陳舊的生物檢材檢驗(yàn)的成功率和靈敏度也更高。采用血清學(xué)方法對(duì)于弱分泌型個(gè)體除血液外其他體液成分進(jìn)行ABO血型檢驗(yàn)時(shí)，常常由于其中抗原成分過(guò)少而無(wú)法檢驗(yàn)，甚至得到錯(cuò)誤判型。而采用ABO血型基因分型方法時(shí)，直接檢驗(yàn)其血型決定基因，因此不受個(gè)體分泌狀態(tài)的影響，可以直接獲得準(zhǔn)確結(jié)論。

性犯罪中的精液與陰道液混合斑是法醫(yī)物證鑒定中常見(jiàn)的生物檢材，采用血清學(xué)方法只能獲得混合的ABO血型，再采用加減法進(jìn)行排除分析；采用基因分型的方法由于首先去除了混合斑中的女性成分，可以直接確定精子的血型?；驍U(kuò)增方法檢測(cè)血型適合于檢測(cè)微量樣本。血清學(xué)檢測(cè)抗原抗體反應(yīng)，信號(hào)放大倍數(shù)通常是幾倍或十幾倍，靈敏度較低，而PCR方法先將基因擴(kuò)增至少105－106倍后檢測(cè)，靈敏度大大提高。

本組實(shí)驗(yàn)中所有檢材兩個(gè)試劑盒共同的13個(gè)基礎(chǔ)位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果完全相同，說(shuō)明16BT試劑盒靈敏度較高，可靠性好，符合目前實(shí)際辦案的需要。

4 典型案例

2012年4月30日，我DNA檢驗(yàn)室受理某市公安局刑警大隊(duì)送檢案件。據(jù)送檢人介紹：2012年4月28日19時(shí)40分許，該市某鎮(zhèn)居民發(fā)現(xiàn)自己7歲大的孫女失蹤，并于當(dāng)晚22時(shí)06分報(bào)案。民警與其親屬50余人在附近尋找一夜未果。4月29日11時(shí)10分，在其家屬區(qū)東側(cè)60米處的防水溝內(nèi)發(fā)現(xiàn)了失蹤女童的尸體。經(jīng)技術(shù)人員現(xiàn)場(chǎng)勘查，初步確定為強(qiáng)奸殺人案。

DNA檢驗(yàn)室受理此案后，首先確定了檢驗(yàn)方案。為了給辦案機(jī)關(guān)節(jié)約辦案成本，我們利用16BT試劑盒成功檢驗(yàn)出送檢生物物證中犯罪嫌疑人的常染色體STR多態(tài)性分型結(jié)果的同時(shí)，還檢驗(yàn)出犯罪嫌疑人為BO的雜合體。所以我們建議辦案機(jī)關(guān)首先送檢B型血的犯罪嫌疑人血樣。這無(wú)疑既幫助送檢機(jī)關(guān)減少了工作量，又為快速破案爭(zhēng)取了時(shí)間。終于，在第三批送檢的B型嫌疑人血樣里，我們找到了真正的兇犯，犯罪嫌疑人被成功批捕。

1.侯一平，王保捷.法醫(yī)物證學(xué)[M].第二版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2004

2.裴黎.現(xiàn)代DNA分析技術(shù)理論與方法[M].北京：人民公安大學(xué)出版社，2002

3.鄭秀芬.法醫(yī)DNA分析［M］.北京：中國(guó)人民公安大學(xué)出版社，2010

4.胡蘭.法醫(yī)遺傳學(xué)進(jìn)展與應(yīng)用[M].北京：群眾出版社，2008

5.Wang Hong-xu，Wei Zheng，Yong Bingxiang，etal.ABO bloodtypeisassociatedwithendometrial cancer risk in Chinese women[J].Chinese journal of cancer，2011，(11)