火針治療對(duì)大鼠跟腱末端病HSP70表達(dá)的影響

史清釗　郭佳佳　張玉芹　方小芳

摘要：通過(guò)比較1次與4次火針治療后大鼠跟腱末端區(qū)HSP70表達(dá)變化，探討火針治療末端病的作用機(jī)理，為末端病的火針治療提供理論依據(jù)。采用“電擊跳躍法”建立大鼠跟腱末端病模型，并對(duì)模型進(jìn)行火針治療。采用ABC法檢測(cè)HSP70表達(dá)，在40倍物鏡下進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果表明：治療1組纖維軟骨區(qū)、腱骨關(guān)節(jié)面軟骨的HSP70陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照1組 （P<0.05）；治療2組纖維軟骨區(qū)、腱骨關(guān)節(jié)面軟骨的HSP70陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照2組（P<0.05）；治療3組腱骨關(guān)節(jié)面軟骨的HSP70陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照3組（P<0.05）；治療4組腱骨關(guān)節(jié)面軟骨的HSP70陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照4組（P<0.05）；治療5組纖維軟骨區(qū)、腱骨關(guān)節(jié)面軟骨的HSP70陽(yáng)性率非常顯著高于對(duì)照5組（P<0.01）。得出結(jié)論：1）1次火針治療誘導(dǎo)末端區(qū)合成大量HSP70，主要表現(xiàn)在纖維軟骨區(qū)、腱骨關(guān)節(jié)面軟骨2個(gè)部位，使末端區(qū)組織和細(xì)胞對(duì)壞死、損傷產(chǎn)生抵抗，同時(shí)促進(jìn)壞死、損傷組織和細(xì)胞的修復(fù)，對(duì)末端病的恢復(fù)起到了一定的促進(jìn)作用。2）4次火針治療后這2個(gè)部位的陽(yáng)性率明顯高于1次火針治療，4次火針治療能更進(jìn)一步促進(jìn)末端病的恢復(fù)。

關(guān)鍵詞： 火針；跟腱；末端??；HSP70

中圖分類號(hào)： G 804.2文章編號(hào)：1009-783X（2012）04-0376-05文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

末端病是指肌腱、韌帶、關(guān)節(jié)囊纖維層在骨上附著部分發(fā)生勞損性變性而引起的疾患^[1]。其發(fā)病部位多在四肢關(guān)節(jié)部位。例如，網(wǎng)球肘（肱骨外上髁炎）、肩袖損傷、跳躍膝、跟痛癥等。末端病屬慢性軟組織損傷，治療困難，且隨著競(jìng)技體育和全民健身運(yùn)動(dòng)的發(fā)展，其發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)?；疳樉哂行袣饣钛?、溫通經(jīng)絡(luò)和緩解炎癥的作用，對(duì)各種慢性軟組織損傷有顯著療效。經(jīng)臨床驗(yàn)證，用火針治療網(wǎng)球肘^[2-3]、肩周炎^[4]、跟痛癥^[5]等成功的病例已經(jīng)有很多，且隨著施針次數(shù)的增加，恢復(fù)效果更明顯，至4次時(shí)已經(jīng)基本痊愈，但涉及到作用機(jī)制的報(bào)道卻很少。

研究證實(shí)，HSP70是在高溫應(yīng)激下合成最為迅速、表達(dá)最為豐富的一種蛋白^[6]。在末端病中，HSP70的表達(dá)可以保護(hù)受損組織和加速修復(fù)^[7-9]?；疳槸煼ㄊ菍⑨樉咴诨鹕蠠t至發(fā)白發(fā)亮后快速刺入病體內(nèi)，此時(shí)針身溫度可超過(guò)800 ℃，這種高溫產(chǎn)生的熱刺激，對(duì)于受損的末端區(qū)組織來(lái)說(shuō)可作為一種應(yīng)激原，可以誘導(dǎo)跟腱末端區(qū)發(fā)生熱休克反應(yīng)，使HSP70合成增加。本文通過(guò)檢測(cè)火針治療大鼠跟腱末端病后末端區(qū)的HSP70變化，探討火針治療末端病的作用機(jī)制，為末端病的火針治療方法提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)備

1）自制電刺激造模裝置（如圖1所示）：長(zhǎng)55 cm，寬40 cm，高75 cm，其頂部完全沒(méi)有遮蓋；四周為光滑的有機(jī)玻璃，其底部為縱向排列的有一定間隔的銅棒，分別固定于木架上。電路兩端連接一個(gè)變壓器（調(diào)控電壓范圍在0～220 V）和一個(gè)帶有計(jì)數(shù)器、計(jì)時(shí)器及電路短路報(bào)警信號(hào)燈的數(shù)控裝置。在造模裝置底部通電，使2個(gè)銅棒之間有電壓，當(dāng)大鼠的足部同時(shí)踩在相鄰的2個(gè)銅棒上時(shí)，通過(guò)大鼠足部的電流迫使其向上跳躍，雙足跳離銅棒即為有效跳躍。這樣使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物完全模擬運(yùn)動(dòng)員的動(dòng)作和訓(xùn)練狀態(tài)，使造模結(jié)果與人體末端病更為接近。

2）細(xì)火針：購(gòu)于北京中醫(yī)藥研究所。火針全長(zhǎng)7.8 cm，柄長(zhǎng)3.7 cm，直徑為0.40 mm。

1.2實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組

1月齡雄性SD大鼠88只，體重（110±10）g。購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于北京301醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，將大鼠隨機(jī)分為2個(gè)大組：安靜對(duì)照組8只和造模組80只。

1.3造模方法

大鼠造模訓(xùn)練是參照姚小衛(wèi)、扈盛等所確定的“電擊跳躍法”而進(jìn)行的^[10-11]。正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，先進(jìn)行3 d適應(yīng)性訓(xùn)練，每只每天20 min。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，將治療組和對(duì)照組大鼠放在自制電刺激造模裝置內(nèi)，一次8只。每15 s通電1次，持續(xù)20 min，休息10 min，再持續(xù)20 min。每天訓(xùn)練1次，每周一至周六進(jìn)行，周日休息，持續(xù)訓(xùn)練8周。通電電壓逐步加大，直到大鼠出現(xiàn)有效跳躍為止，一般在50 V左右，個(gè)別情況下達(dá)到80～100 V。

1.4火針治療

將造模組隨機(jī)分為治療1、2、3、4、5組與對(duì)照1、2、3、4、5組，每組8只。其中，1～4組為1次火針治療組，5組為4次火針治療組。將大鼠固定，暴露其后肢，用酒精燈火焰燒細(xì)火針至發(fā)白亮，然后用火針于大鼠跟腱痛點(diǎn)處點(diǎn)刺，深度約為3 mm，分別對(duì)1次火針治療組，4次火針治療（1次/3d）組進(jìn)行施針，每次治療只施針1次，每日治療均在09：00—10：00期間進(jìn)行。

1.5取材及組織切片制作

1次火針治療組施針后于第1、2、3、4天分別處死治療1、2、3、4組及其相應(yīng)對(duì)照組，并在第1 d處死安靜對(duì)照組取材。4次火針治療組在完成第4次治療3 d后進(jìn)行取材。取大鼠單側(cè)后足跟腱和完整的跟腱末端區(qū)組織。將取下的組織分別放入10%甲醛固定液中，置于4 ℃冰箱保存24 h。之后用脫鈣液進(jìn)行脫鈣，每3 d更換一次脫鈣液并搖勻，連續(xù)脫鈣5周。脫鈣完畢后將組織塊用自來(lái)水沖洗3 h后，然后上行酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。石蠟切片機(jī)切片，每個(gè)標(biāo)本連續(xù)切片6～8張，切片厚度6 μm，用涂有多聚賴氨酸的載玻片附片，40 ℃烘烤2 h后室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6測(cè)試指標(biāo)及方法

1.6.1HE染色

檢測(cè)地點(diǎn)：中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心。常規(guī)HE染色。

1.6.2HSP70檢測(cè)

檢測(cè)地點(diǎn)：中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心。

采用ABC法進(jìn)行HSP70的檢測(cè)，以及陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。HSP70檢測(cè)試劑盒：購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.7圖像采集及處理

1.7.1HE染色

HE染色后用Olympus BX-51顯微鏡在10倍和20倍物鏡下分別觀察跟腱末端區(qū)跟腱（T）、纖維軟骨區(qū)（UF）、鈣化軟骨區(qū)（MF）、跟骨（C）、腱骨關(guān)節(jié)面軟骨（CA）、腱圍組織（PT）的組織和細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.7.2HSP70檢測(cè)

光鏡下觀察細(xì)胞漿及細(xì)胞核中呈現(xiàn)出棕黃色顆粒的部位即為表達(dá)處。每個(gè)標(biāo)本選取一張切片，觀察末端區(qū)跟腱（T）、纖維軟骨區(qū)（UF）、鈣化軟骨區(qū)（MF）、跟骨（C）、腱骨關(guān)節(jié)面軟骨（CA）共5個(gè)區(qū)域。最后在Olympus BX-51顯微鏡上觀察，每個(gè)區(qū)域觀察5個(gè)視野（不重復(fù)，不重疊），并在40倍物鏡下拍照，對(duì)每個(gè)視野進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，并計(jì)算HSP70陽(yáng)性率（HSP70陽(yáng)性率=5個(gè)視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)之和/5個(gè)視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)）。

1.8統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS 13.0處理，數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，經(jīng)單因素方差分析進(jìn)行組間差異比較。當(dāng)方差齊性時(shí)，用LSD post-hoc檢驗(yàn)；當(dāng)方差不齊時(shí)，用Tamhane post-hoc檢驗(yàn)。P<0.05代表顯著性差異，P<0.01代表非常顯著性差異。

2結(jié)果

2.1HE染色結(jié)果

安靜對(duì)照組大鼠跟腱主要由平行的腱纖維組成，呈波浪狀彎曲排列。在纖維束之間，有成行排列呈梭型的腱細(xì)胞，體積較小，中央有橢圓形的細(xì)胞核，細(xì)胞核大，占整個(gè)細(xì)胞的大部分，纖維軟骨區(qū)內(nèi)Sharpey氏纖維相互交織成束。在Sharpey氏纖維之間，可見(jiàn)大量的軟骨陷窩，每個(gè)陷窩內(nèi)有1～2個(gè)呈橢圓形的軟骨細(xì)胞緊挨在一起；潮線曲線平滑，其彎曲弧度與跟骨的輪廓基本一致；鈣化軟骨區(qū)與跟骨之間無(wú)明顯分界，染色均勻，細(xì)胞數(shù)目較少；跟骨骨小梁呈片狀，骨髓腔內(nèi)有大量脂肪組織空泡；腱骨關(guān)節(jié)面輪廓清晰，邊緣光滑；腱圍內(nèi)血管豐富，纖維輪廓明顯，排列不規(guī)則，細(xì)胞數(shù)目較多^[12]。

造模組大鼠末端區(qū)均出現(xiàn)明顯的末端病病理變化，與文獻(xiàn)報(bào)道一致^[12]。1）跟腱：對(duì)照組腱纖維出現(xiàn)排列紊亂，甚至斷裂，波浪狀彎曲消失，并發(fā)現(xiàn)多處呈紅染的玻璃樣變性區(qū)；2）纖維軟骨區(qū)：此區(qū)明顯增厚，遠(yuǎn)側(cè)端出現(xiàn)明顯鈣化，潮線呈現(xiàn)“火焰”狀向纖維軟骨區(qū)漲潮；3）鈣化軟骨區(qū)和跟骨，染色不均勻，細(xì)胞數(shù)量不多，體積比纖維軟骨區(qū)的細(xì)胞大，細(xì)胞質(zhì)豐富，基質(zhì)中有時(shí)可見(jiàn)沉積巖樣的層狀排列；4）腱骨關(guān)節(jié)面軟骨：軟骨層明顯增厚，關(guān)節(jié)面輪廓模糊不規(guī)則，偶見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；5）腱圍：水腫、增厚，血管輕度擴(kuò)張，偶見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.2HSP70表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

安靜對(duì)照組大鼠跟腱末端區(qū)各部位未見(jiàn)明顯的HSP70表達(dá)，陽(yáng)性個(gè)數(shù)、陽(yáng)性率、平均灰度均為0。

與安靜對(duì)照組相比，造模組大鼠末端區(qū)在跟腱、纖維軟骨區(qū)、腱骨關(guān)節(jié)面軟骨3個(gè)部位的HSP70陽(yáng)性率有非常顯著升高（P<0.01）。部分大鼠鈣化軟骨區(qū)、跟骨也出現(xiàn)少量陽(yáng)性細(xì)胞，但與安靜對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異（P>0.05）。

與對(duì)照組相比，治療組大鼠末端區(qū)主要在纖維軟骨區(qū)、腱骨關(guān)節(jié)面軟骨2個(gè)部位的HSP70陽(yáng)性率有不同程度升高（如圖2、3、4、5所示）。其中：治療1、2組在纖維軟骨區(qū)、腱骨關(guān)節(jié)面軟骨的HSP70陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照1、2組，呈顯著性差異（P<0.05）；治療3、4組僅在腱骨關(guān)節(jié)面軟骨的HSP70陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照3、4組，呈顯著性差異（P<0.05）；治療5組在纖維軟骨區(qū)、腱骨關(guān)節(jié)面軟骨2個(gè)部位的HSP70陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照5組，呈非常顯著性差異（P<0.01）。而在跟腱、鈣化軟骨區(qū)、跟骨的HSP70陽(yáng)性率比對(duì)照組雖有所升高，但均無(wú)顯著性意義（P>0.05），見(jiàn)表2、3。