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      綠色熒光蛋白在貴陽腐霉的組成性表達

      2012-04-29 13:36:20劉萍鄭慧玲吳建偉蘇曉慶
      湖北農業(yè)科學 2012年24期

      劉萍 鄭慧玲 吳建偉 蘇曉慶

      摘要:以潮霉素抗性基因hph為篩選標記,以雙元載體pPK2為基本骨架,將增強型綠色熒光蛋白基因egfp置于組成型啟動子PgpdA和色氨酸C終止子TtrpC之間,構建了組成性表達egfp的載體pPK2-EGFP,利用根癌農桿菌介導的遺傳轉化法,轉入貴陽腐霉(Pythiumguiyangense)表達。對轉化子進行RT-PCR和熒光顯微鏡檢測,結果表明,egfp基因在貴陽腐霉轉化子中能穩(wěn)定表達。

      關鍵詞:貴陽腐霉(Pythiumguiyangense);基因轉化;綠色熒光蛋白;根癌農桿菌

      中圖分類號:Q786 文獻標識碼:A 文章編號:0439-8114(2012)24-5801-03

      貴陽腐霉(Pythiumguiyangense)是貴陽醫(yī)學院蘇曉慶教授于1994年分離得到的一株滅蚊真菌[1]。經研究證實它具有滅蚊能力較強、繁殖速度快、易于人工培養(yǎng)[2]和可移植性強以及對非靶生物相對安全等諸多優(yōu)點[3,4]。由于昆蟲病原真菌廣泛存在于自然界,真菌制劑一旦釋放到自然環(huán)境中,需要準確鑒別染病昆蟲是否為人工釋放的菌株制劑所致,而在真菌制劑中引入安全、可靠的遺傳標記則為其提供了可能。增強型綠色熒光蛋白(Enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)是一種優(yōu)化的突變型綠色熒光蛋白,其熒光比野生型強35倍,具有結構穩(wěn)定、高效表達、無種系依賴性等特點,通過與目標基因融合,可進行真菌的細胞基因表達和蛋白定位檢測及細胞示蹤標記、突變體致病力檢測、生態(tài)學行為以及與其他生物互作等研究,因此是目前標記研究真菌的重要手段之一。此次研究以貴陽腐霉菌絲體為受體材料,利用根癌農桿菌介導的遺傳轉化技術將含egfp的表達載體轉入貴陽腐霉,以獲得帶有EGFP標記的貴陽腐霉菌株,為研究其對蚊幼蟲的入侵過程以及兩者之間的互作模式打下基礎。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.3 引物 試驗所用引物序列見表1。

      1.2 方法

      1.2.1 egfp組成性表達載體pPK2-EGFP的構建 用限制性內切酶HindⅢ和BamHⅠ酶切質粒pSK-hph,回收TtrpC片段(770bp),與用相同酶切的質粒pUC18連接轉化,重組載體命名為pUC18-TtrpC。以質粒pEGFP-C1為模板,pEGFP1和pEGFP2為引物,PCR擴增egfp基因片段,用BamHⅠ和 BglⅡ雙酶切后純化回收,與同樣雙酶切的pUC18-TtrpC連接,轉化驗證,命名為pUC18-TtrpC-EGFP。以質粒pAN7-1為模板,用引物PgpdA1和PgpdA2PCR擴增PgpdA基因片段,用KpnⅠ和BamHⅠ雙酶切后純化,回收該目的片段,與經過相同雙酶切的載體pUC18-TtrpC-EGFP連接,命名為pUC18-TtrpC-EGFP-PgpdA,提取其質粒,用HindⅢ酶切后電泳,凝膠回收3.6kb的大片段PgpdA-EGFP-TtrpC,與相同酶切的質粒pPK2連接,篩選陽性轉化子,用BamHⅠ單酶切驗證,得到正向連接的轉化子為質粒pPK2-EGFP。

      1.2.2 pPK2-EGFP的根癌農桿菌LBA4404轉化 采用凍融法[5]。

      1.2.3 根癌農桿菌介導的egfp基因在貴陽腐霉的遺傳轉化 按龍朝欽等[6]的方法稍改動。取含質粒pPK2-EGFP的LBA4404過夜培養(yǎng)物,用含200μmol/LAS的YEP液體培養(yǎng)基于28℃振蕩培養(yǎng)6h后,與貴陽腐霉菌絲混合,于26℃培養(yǎng)1d。棄上清,加入500μLIM液體培養(yǎng)基(含200μmol/LAS),于26℃培養(yǎng)2d。懸浮沉淀,將該混合物涂布到KPYG2平板上(含200mg/L潮霉素B和200mg/L頭孢霉素),于26℃培養(yǎng)直至抗性菌絲長出。

      1.2.4 轉化子的RT-PCR檢測 貴陽腐霉及轉化子總RNA的提取采用TRIZOLReagent(Invitrogen)提取。用PrimeScriptRTReagentKitwithgDNAErase(TaKaRa)逆轉錄并去除基因組DNA。以pEGFP1和pEGFP2為引物,利用PCR對得到的抗性菌落進行分子驗證,擴增egfp基因片段。

      1.2.6 熒光的觀察 臨時制片,利用Olympus熒光顯微鏡在波長480nm下進行熒光觀察、照相。

      2 結果與分析

      2.1 egfp組成性表達載體pPK2-EGFP的構建與酶切驗證結果

      2.2 組成性表達egfp重組菌株的篩選與驗證

      2.3 貴陽腐霉轉化株egfp的熒光檢測

      3 討論

      綠色熒光蛋白(EGFP)來源于海洋生物水母Aequoreavictoria,其作為報告基因已被廣泛地應用于絲狀真菌生物學研究中。2009年,DeSilva等[7]將帶EGFP標記的植物病原真菌Sclerotiniasclerotiorum接種4種植物宿主,通過對熒光的直接定量研究它對不同植物的損害情況。2008年,Rajasekaran等[8]將帶有EGFP標記的曲霉菌接種到棉花種子中,利用EGFP標記監(jiān)測真菌的生長、侵染途徑、定殖以及黃曲霉毒素的產生。另外,Hu等[9]利用含有EGFP的金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)基因重組菌株,研究在植物根際不同深度土壤中,昆蟲、植物和真菌三者之間的相互作用。金凱等[10]將組成性表達egfp的球孢白僵菌轉化株接種菜青蟲,利用冰凍切片和熒光顯微觀察技術可清楚地檢測到病原菌在昆蟲體表附著、菌絲穿透體壁以及菌絲從寄主體內長出等侵染過程。牛秋紅等[11]也構建了含egfp的重組質粒,轉化粉紅粘帚霉,為研究真菌侵染機理的模型打下了試驗基礎。

      貴陽腐霉是一種重要的昆蟲病原真菌,開發(fā)其真菌制劑用于蚊蟲的生物防治很有價值。RT-PCR和熒光顯微檢測顯示,egfp基因在貴陽腐霉中已穩(wěn)定表達,生物測定試驗也表明,具有較強熒光的轉化子的毒力與野生菌株相比沒有明顯改變。這一新的活體報告基因將在貴陽腐霉的侵染過程研究、基因調控、信號轉導及發(fā)育生物學和細胞生物學等多個領域中有更廣泛的應用。

      參考文獻:

      [1]SUXQ.AnewspeciesofPythiumisolatedfrommosquitolarvaeanditsITSregionofrDNA[J].Mycosystema,2006,25(4):523-528.

      [2]HUANGSW,SUXQ.BiologicalstudiesonPythiumguiyangense,afungalpathogenofmosquitolarvae[J].Mycosystema,2007,26(3):380-388.

      [3]劉 萍,蘇曉慶.滅蚊真菌貴陽腐霉Pythiumguiyangense對大鼠的長期安全性測試[J].菌物學報,2007,26(3):440-447.

      [4]劉 萍,蘇曉慶.滅蚊真菌貴陽腐霉對幾種動物的急性安全性測試[J].貴陽醫(yī)學院學報,2007,32(4):331-336.

      [5]張邊江,陳全戰(zhàn).質粒導入不同種農桿菌凍融法的探討[J].湖北農業(yè)科學,2007,46(3):329-331.

      [6]龍朝欽,鄧 軍,郝 飛,等.根癌農桿菌介導的煙曲霉轉化條件的優(yōu)化[J].西部醫(yī)學,2008,20(2):261-264.

      [7]DESILVAAP,BOLTONMD,NELSONBD.TransformationofSclerotiniasclerotiorumwiththegreenfluorescentproteingeneandfluorescenceofhyphaeinfourinoculatedhosts[J].PlantPathology,2009,58(3):487-496.

      [8]RAJASEKARANK,CARYJW,COTTYPJ,etal.DevelopmentofaGFP-expressingAspergillusflavusstraintostudyfungalinvasion,colonization,andresistanceincottonseed[J].Mycopathologia,2008,165(2):89-97.

      [9]HUG,STLEGERRJ.Fieldstudiesusingarecombinantmycoinsecticide(Metarhiziumanisopliae)revealthatitisrhizospherecompetent[J].ApplEnvironMicrobiol,2002,68(12):6383-6387.

      [10]金 凱,張永軍,羅志兵,等.利用GFP表達系統(tǒng)檢測球孢白僵菌侵染昆蟲過程[J].菌物學報,2008,27(3):377-384.

      [11]牛秋紅,柯 濤,張 林,等.適用于粉紅粘帚霉綠色熒光標記的重組質粒的構建及應用[J].微生物學報,2011,51(7):991-997.

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