趙虹 張宇飛 林梅 廖芳麗 熊先鋒 涂書新 張凱

摘要：試驗將同一樣品用不同引物檢測純度，發(fā)現不同引物檢出的純度結果不同。用SSR法檢出的純度結果不同引物之間的誤差隨著樣品田間純度的增高而呈現出降低的趨勢。當品種不同時，室內檢測結果有可能高于或低于田間鑒定結果。因此難以找到普遍適用的室內與室外檢測的系統誤差校正方法。

關鍵詞：兩系雜交稻；同一樣品；不同引物；SSR法；田間鑒定；純度比較

中圖分類號：S511；Q789文獻標識碼：A文章編號：0439-8114（2012）20-4458-02

利用SSR分子標記鑒定兩系雜交稻種子純度，具有快速、穩(wěn)定、重復性好、多態(tài)性高的優(yōu)點，是目前室內鑒定兩系雜交稻種子純度時應用最為廣泛的分子標記方法。該方法一般是從大量的引物中篩選出多態(tài)性高、共顯性強、雙親譜帶清晰的一對引物，然后用這對引物來鑒定兩系雜交稻種子的純度[1-5]。在試驗操作中篩選出的引物往往不止一種，這些引物對同一品種都具有多態(tài)性，且都符合引物篩選的標準。這就意味著多對引物都可用于一個品種的純度鑒定，為篩選引物和鑒定品種提供了方便。就完全相同的一份樣品而言，用不同引物鑒定是否都能得出相同的純度結果，很少見諸報道[6-10]。此次研究的目的在于探討同一樣品用3～4對不同的引物檢測純度，并與田間鑒定結果比對，分析不同引物檢測結果的差異，判斷不同引物檢測兩系雜交稻種子純度的準確性和可靠性。

1材料與方法

1.1材料

試驗所用品種苯兩優(yōu)639、天兩優(yōu)616、兩優(yōu)17均為湖北省種子管理局提供，2010年已做過田間正季鑒定，分別代表全省當年種子純度高、中、低3個類型的樣本群體。

所用引物及試劑均由北京鼎國生物有限公司提供。

1.2引物選擇和DNA模板制備

各品種所用的引物已由前面試驗篩選出，其中兩優(yōu)17和天兩優(yōu)616選用4對引物，苯兩優(yōu)639選用3對引物（表1）。DNA模板的制備采用農業(yè)部推薦的簡易法，其中，用于SSR引物篩選的DNA模板為田間10個標準單株的混合物，用于種子純度鑒定的DNA模板為樣品單株DNA提取物。

1.3PCR反應體系

PCR擴增反應總體積10 μL：10×buffer 1 μL，10 mmol/L dNTP 0.2 μL，50 ng/μL primer 0.2 μL+0.2 μL，2 U/μL Taq 酶0.6 μL，25 ng/μL DNA 1 μL，ddH2O 6.8 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性4 min；然后進行35個循環(huán)的擴增，循環(huán)參數為94 ℃、15 s，55 ℃、15 s，72 ℃、30 s；最后在72 ℃下延伸7 min。擴增產物在含EB的3%瓊脂糖凝膠中進行電泳后，應用凝膠成像系統觀察記錄。

1.4田間純度鑒定及單株定位方法

以上3個品種都進行了田間正季鑒定，于2011年4月15日播種，5月15日移栽。每品種田間種植1個小區(qū)，每小區(qū)500株，50行，每行10株，行距26.7 cm，株距16.7 cm。每個植株用4位數編號，前兩位數代表所在的行數，后兩位數表示所在行的位置，例如0508表示第五行的第八株，并設親本對照。在抽穗前及齊穗后分兩次按GB/T 3543.5—1995進行田間純度鑒定，并觀察比較各品種間的植物學形態(tài)特征和生物學特性。

1.5室內鑒定

在秧苗移栽20 d后，在田間按植株編號逐株剪取倒數第二葉，用于SSR法室內純度檢測，其中兩優(yōu)17有效鑒定株數495株，天兩優(yōu)616有效鑒定株數316株，苯兩優(yōu)639有效鑒定株數344株。

1.6室內及田間鑒定結果比對

將同一品種使用不同引物作出的室內鑒定結果與田間鑒定結果比較，并比較不同引物室內鑒定結果之間的差異，判斷不同引物檢測結果的準確性與一致性。

2結果與分析

2.1同一樣品不同方法的鑒定結果比較

無論是田間方法還是室內方法鑒定，3個樣品的純度從低到高依次為兩優(yōu)17、天兩優(yōu)616、苯兩優(yōu)639（表2）。

室內鑒定結果與田間鑒定結果是不一致的。室內鑒定結果與田間鑒定結果比較，兩優(yōu)17的4對不同引物鑒定結果中，與田間鑒定結果差距最小的為RM212，比田間純度低1.2個百分點，差距最大的為RM21，比田間純度低5.2個百分點；苯兩優(yōu)639的3對不同引物鑒定結果中，與田間鑒定結果差距最小的為RM17和RM208，均比田間純度高0.2個百分點，差距最大的為RM263，比田間純度高0.8個百分點；天兩優(yōu)616的4對不同引物鑒定結果中，與田間鑒定結果差距最小的為RM243，比田間純度高1.0個百分點，差距最大的為RM263，比田間純度高3.2個百分點。就不同品種而言，有的室內純度鑒定結果高于田間鑒定結果，有的室內純度鑒定結果低于田間鑒定結果，其中，兩優(yōu)17的室內鑒定，所有引物鑒定結果純度都比田間低，平均低2.6個百分點；天兩優(yōu)616的室內鑒定，所有引物鑒定結果純度都比田間高，平均高1.8個百分點；苯兩優(yōu)639的室內鑒定，所有引物鑒定結果純度都比田間高，平均高0.4個百分點。

2.2同一樣品不同引物檢測結果比較

同一樣品不同引物檢出純度有差異。兩優(yōu)17引物間純度最大相差4.0個百分點，達4.67%；與田間純度比較最大相差5.2個百分點，達6.08%，這已經超出了誤差允許范圍。天兩優(yōu)616引物間純度最大相差2.2個百分點，達2.30%；與田間純度比較最大相差3.2個百分點，達3.35%。苯兩優(yōu)639各引物間純度相近，與田間純度鑒定結果也基本一致，可見室內SSR檢出純度是田間純度的近似值。

3結論與討論

試驗中，純度較高的種子樣品室內多對引物的SSR法和田間鑒定的結果差異較小，否則差異較大。同時也存在下述問題，值得探討。

3.1引物篩選時，應該關注引物對樣品的針對性

兩優(yōu)17用引物RM21檢出的純度為85.5%，比目前公認的田間鑒定法低5.2個百分點，相對誤差達6.08%，已超出了統計學可忽略的誤差范圍。而引物RM212檢出的純度為89.5%，比田間鑒定法低1.2個百分點，接近大田生產鑒定結果，說明引物對樣品純度的分子生物學鑒別能力不同。因此，當樣品純度較低時，篩選出的引物對樣品是否有針對性顯得尤為重要。

3.2室內鑒定與田間鑒定結果之間有差距，且差距變化的方向不確定

從試驗中看出，受檢品種用SSR法檢測的純度結果有的高于田間純度鑒定結果，有的低于田間純度鑒定結果，誤差的變化方向擺動不定。例如兩優(yōu)17用多個引物檢出的純度均低于田間純度，而天兩優(yōu)616均高于田間純度。這說明室內與田間兩種純度檢測方法所測出的結果之間具有復雜性，而尋求某種簡便通用的誤差校正方法存在較大的難度。

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