于瑤　張漢堯　杜建偉

摘要：提取分布于云南高原濕地的水蔥（Scirpus validus Vahl.）樣品的DNA，采用ITS 序列擴(kuò)增通用引物，對其進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。從GenBank搜索并下載水蔥屬其他種類的ITS序列，并通過BioEdit、ClustalX 2.02和MEGA 4x1軟件分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。分析結(jié)果揭示了水蔥屬14個種之間的親緣關(guān)系，并確定了樣品在種間的位置以及和其他種的親緣關(guān)系。

關(guān)鍵詞：水蔥（Scirpus validus Vahl.）；ITS序列；系統(tǒng)發(fā)育樹

中圖分類號：Q523+.8；Q949.71+4.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）20-4549-02

濕地生態(tài)系統(tǒng)是一類重要的自然生態(tài)系統(tǒng)，中國云貴高原、青藏高原分布著不同海拔的高原濕地。植被和植物群落特征是顯示高原湖泊濕地的自然性、特殊性、多樣性、演變階段、消退階段的最好指示要素。水蔥是云南高原濕地挺水植被群落中常見的分布最為廣泛的優(yōu)勢群落。水蔥的拉丁學(xué)名為Scirpus validus Vahl.，為莎草科多年生宿根挺水草本植物，生長在湖邊、水邊、淺水塘、沼澤地或濕地草叢中，在中國南北方分布廣泛，是構(gòu)建人工濕地系統(tǒng)、進(jìn)行污水凈化的常用挺水植物，也是常用的景觀綠化植被。

ITS序列是在rDNA基因中16 S rDNA和28 S rDNA基因的間隔序列，也被稱為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，ITS 序列在被子植物中的長度變異很小，承受的選擇壓力較小，相對變化較大，并且能夠提供詳盡的系統(tǒng)學(xué)分析所需要的可遺傳性狀。因此，其常被用于研究被子植物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，尤其是近緣屬間及種間關(guān)系[1-3]。ITS序列和matK、rbcL序列[4]一樣都是在研究物種遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)育、物種起源及物種確定上常用的依據(jù)[5-8]。

本研究以分布于云南高原濕地中的水蔥為樣品，通過克隆其基因組DNA的ITS片段，并與NCBI上已收錄的其他水蔥屬各種植物的ITS序列比較。明確其在水蔥屬各種間的系統(tǒng)發(fā)育樹上的位置，為水蔥的遺傳改良及研究水蔥屬種間的系統(tǒng)發(fā)育提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)材料采集于云南省大理州劍川縣的劍湖。采集地水蔥株高1～2 m，莖桿高大通直，桿呈圓柱狀，中空，多散生。

1.2方法

1.2.1總DNA的提取采用新鮮幼嫩的水蔥水上部分，放入液氮中研磨成粉末，用生工生物工程（上海）股份有限公司的植物基因組提取試劑盒提取高質(zhì)量的水蔥總DNA。

1.2.2PCR擴(kuò)增參考文獻(xiàn)[8]，PCR反應(yīng)體系包括由北京百泰克生物技術(shù)有限公司合成的ITS通用引物JK5.8F（5′-GAT ACT TGG TGT GAA TTG CAG A-3′）、ITS4（5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′）各2 μL，雙鏈DNA模板2 μL，北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的2×Power Taq PCR MasterMix 25 μL，用去離子水補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性6 min；94 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共40個循環(huán)；最后于72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠、0.5×TBE電泳緩沖液中電泳，電壓不超過5 V/cm，用溴化乙錠（EB）浸染，在UVP凝膠成像儀上觀察并攝影。用回收試劑盒回收純化擴(kuò)增片段，純化后直接作為測序用模板。

1.2.3DNA的序列分析首先用BioEdit軟件對測序結(jié)果進(jìn)行調(diào)整，轉(zhuǎn)換格式，利用ClustalX 2.02軟件完成DNA序列的對比，保存ALN格式，然后運(yùn)用MEGA 4x1軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，應(yīng)用自展法（Bootstrap，1 000 Replicates）進(jìn)行可信度檢測，對空位做缺失處理，使用1 000次重復(fù)抽樣計算鄰接樹（Neighbor-joining tree，NJ），模型選擇核算P-distance，構(gòu)建水蔥屬各種之間的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2結(jié)果與分析

2.1樣品PCR擴(kuò)增后的電泳結(jié)果

采集水蔥樣本，提取基因組DNA，用PCR擴(kuò)增后獲得了單一的目的條帶，獲得的樣品的ITS區(qū)域的序列片段長度為500 bp，PCR擴(kuò)增獲得的目的片段為5.8 S rDNA片段、大部分ITS2和少量ITS1片段。在GenBank中利用BLAST對比獲得水蔥屬的其他相關(guān)種的ITS序列共計13個（表1）。

2.2樣品ITS的序列分析結(jié)果

由于本試驗(yàn)擴(kuò)增出來的為樣品的ITS部分片段，所以在經(jīng)軟件ClustalX 2.02和MEGA 4x1分析時均選用水蔥屬中各種的相同ITS片段進(jìn)行序列分析，分析結(jié)果表明，本試驗(yàn)所用的14種水蔥屬的植物樣品的ITS片段有364個核苷酸位點(diǎn)，263個恒定信息位點(diǎn)，98個變異信息位點(diǎn)，51個簡約信息位點(diǎn)，46個單個堿基變化位點(diǎn)。該序列的變異信息位點(diǎn)所占比例僅為26.9%。說明水蔥的ITS序列變異不大，而且具有較多的遺傳信息，適用于進(jìn)行遺傳分析。

2.3水蔥屬植物ITS序列的聚類分析結(jié)果

用ClustalX 2.02軟件對14個樣本的ITS序列進(jìn)行了聚類分析，建立了其系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。從聚類分析結(jié)果來看，可以把水蔥屬這14個樣本分為兩大分支，其中Schoenoplectus gitriqueter（三棱水蔥）、S. nipponicus和本試驗(yàn)樣品為一個分支，其余各樣本為一個分支，其中本試驗(yàn)樣品與S. gitriqueter親緣關(guān)系最近，并且又與S. nipponicus聚為一類。但本試驗(yàn)樣本與S. gitriqueter的自展支持率為100%，所以確定為一個獨(dú)立的類群。

3討論

水蔥作為中國高原濕地中常見的分布廣泛的挺水優(yōu)勢群落，是很好的環(huán)境指示植物，并對于濕地水體凈化、水生植被演替都有重要的意義，同時也是重要的濕地景觀植物。但國內(nèi)外相關(guān)研究卻較少。水蔥屬有很多種類，但都沒有系統(tǒng)歸類和鑒別，如研究所檢索到的這14種都沒有很好的中文譯名和鑒別。特別是關(guān)于水蔥的分子生物學(xué)的研究，屬內(nèi)各種的明確定位以及遺傳關(guān)系基本空白。通過ITS序列分析可知，本試驗(yàn)樣品雖然與三棱水蔥親緣關(guān)系最近，但自展支持率為100%，所以很可能是一個獨(dú)立的類群。希望以后有更多的關(guān)于水蔥屬植物以及其他高原濕地植物的研究，以豐富中國高原濕地植被的知識，為中國高原濕地植物的保護(hù)和利用奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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