李文志　董勇　辛毅

[摘要]目的：研究人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、擴增和鑒定方法。方法：采用密度梯度離心法分離人外周血單個核細(xì)胞，用EGM-2培養(yǎng)基在多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)板中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，動態(tài)地觀察貼壁細(xì)胞的生長狀況，免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測培養(yǎng)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)。結(jié)果：人外周血單個核細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)至第2天，呈貼壁生長，細(xì)胞形態(tài)為大小相近的圓球體；第4天一些細(xì)胞開始出現(xiàn)尾狀物，形態(tài)呈蝌蚪樣改變，部分細(xì)胞聚集形成細(xì)胞簇；至第7天細(xì)胞形態(tài)變長，呈梭形改變，細(xì)胞間相互圍繞呈環(huán)形，并有集落出現(xiàn)，免疫組織化學(xué)染色CD133、CD34、VEGFR-2和Ⅷ因子表達(dá)均呈陽性。結(jié)論：運用本實驗方法可以成功實現(xiàn)人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和擴增。

[關(guān)鍵詞]內(nèi)皮祖細(xì)胞；外周血；細(xì)胞培養(yǎng)

[中圖分類號]Q813.1[文獻標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）08-1318-03

內(nèi)皮祖細(xì)胞（Endothelial Progenitor Cells， EPCs）是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，亦稱血管母細(xì)胞（angioblast），EPCs不僅參與胚胎血管生成，而且也參與出生后的血管新生過程。近些年來人們對EPCs在血管形成、心腦血管疾病和創(chuàng)傷愈合等方面的作用進行了廣泛的研究[1]，EPCs移植技術(shù)已成為治療心腦血管疾病的一種新興的方法[2]，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。但由于EPCs的來源有限，目前的培養(yǎng)方法尚不能滿足基礎(chǔ)研究和臨床治療的需要，在本實驗中，筆者研究從來源相對廣泛的人外周血中分離培養(yǎng)EPCs，為EPCs的應(yīng)用提供一種便捷有效的分離方法。

1材料和方法

1.1 材料：主要試劑和儀器：內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（Endothelial Cell Growth Medium-2，EGM-2）（Lonza公司）。人淋巴細(xì)胞分離液（天津灝洋生物制品有限公司）。鼠抗人CD133單克隆抗體、血管內(nèi)皮生長因子受體2（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2，VEGFR-2）（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。鼠抗人CD34單克隆抗體、Ⅷ因子、鼠兔通用型二抗、濃縮型二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine， DAB）試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。多聚賴氨酸、多聚甲醛（Sigama公司）。Olympus倒置顯微鏡（日本）。

1.2 方法

1.2.1 人外周血單個核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC）的分離：采集健康人外周血30ml，肝素抗凝后用（Phosphate Buffer Saline，PBS）稀釋（1：1），稀釋液沿試管壁緩慢加入到人淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll）液面上（血液與Ficoll體積比為2：3），然后將其放到水平離心機內(nèi)以2000r/min速度離心20min。離心后液體從上到下被分為四層，依次為血漿層，單個核細(xì)胞層，淋巴細(xì)胞分離液層，紅細(xì)胞層。吸取單個核細(xì)胞層后加入等體積含有2%胎牛血清的PBS，以1 000r/min速度離心10min，棄上清液，離心兩遍，清洗兩遍。

1.2.2 細(xì)胞的培養(yǎng)和擴增：將分離出的細(xì)胞以10×106個細(xì)胞/孔接種于經(jīng)多聚懶氨酸包被的六孔板中，在溫度為37℃、二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5%、濕度≥95%的條件下，用EGM-2培養(yǎng)基（含胎牛血清、VEGF、青霉素和鏈霉素）培養(yǎng)，隔天換液，換液后用倒置顯微鏡觀查細(xì)胞的生長狀況，并照相。

1.2.3 細(xì)胞表面標(biāo)志物的檢測：細(xì)胞培養(yǎng)至第7天后用洗掉非貼壁細(xì)胞，留下的貼壁細(xì)胞用胰酶消化，消化完成后加完全培養(yǎng)基終止，吸取細(xì)胞液以1 000r/min速度離心10min。將離心后的細(xì)胞加培養(yǎng)基混勻，然后滴加到培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞貼片上，讓細(xì)胞貼片30min后，在培養(yǎng)皿內(nèi)輕輕的添加完全培養(yǎng)液，放于溫度為37℃、二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5%、濕度≥95%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞爬滿爬片。運用二部法免疫組化檢測細(xì)胞表面標(biāo)志CD133、CD34、血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR-2）和Ⅷ因子的表達(dá)，并設(shè)陰性對照組加以對比。

2結(jié)果

3討論

內(nèi)皮祖細(xì)胞不僅參與胚胎組織血管化和出生后的血管生成，還參與機體器官損傷后的血管再生與修復(fù)，在缺血性疾病、預(yù)防血管再狹窄、血管創(chuàng)傷愈合等過程中具有重要的治療作用[3]。1997年，Asahara等[4]首先發(fā)現(xiàn)在循環(huán)外周血中存在能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，并將其命名為血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs），此后，人們發(fā)現(xiàn)骨髓和臍血中也存在EPCs，而且含量遠(yuǎn)多于外周血。盡管如此，由于人外周血較骨髓和臍血取材相對便利且用量易于控制，使外周血分離培養(yǎng)EPCs成為EPCs應(yīng)用研究中的可靠獲取途徑。

生理狀態(tài)下，成人EPCs主要存在于骨髓內(nèi)，外周血中含量低，傳統(tǒng)采用包被抗CD34、VEGFR2或CD133抗體的免疫磁珠分選法進行篩選、分離EPCs。由于EPCs特異性表面標(biāo)志物缺乏，因此通過抗體的免疫磁珠篩選出的EPCs純度高，但數(shù)量少[5]。此外，免疫磁珠分選法的技術(shù)難度大、價格也比較昂貴。為增加實驗用EPCs的數(shù)量，本實驗利用密度梯度離心法將外周血液中的EPCs進行富集，將富集的EPCs與其它單核細(xì)胞一并放入EGM-2培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中有預(yù)先包被多聚懶氨酸的六孔培養(yǎng)板和多種內(nèi)皮生長因子，對外周血中的單核細(xì)胞進行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，利用EPCs的細(xì)胞貼壁特性，在換液過程中將培養(yǎng)基中其它單核懸浮細(xì)胞去除，貼壁單個核細(xì)胞在特定培養(yǎng)基的選擇誘導(dǎo)作用下得以分化生長。

研究結(jié)果顯示，懸浮的混雜細(xì)胞在換液過程被去除后，貼壁細(xì)胞在特殊培養(yǎng)基中培養(yǎng)、誘導(dǎo)、分化下迅速增殖，呈簇狀生長，并形成集落，許多細(xì)胞聚集呈現(xiàn)大小不一的圓環(huán)狀分布，并隨培養(yǎng)時間延長，表現(xiàn)越發(fā)明顯。筆者分析，EPCs圓環(huán)狀生長，可能是其向內(nèi)皮細(xì)胞方向分化過程中的一個特征性表現(xiàn)，通過圓環(huán)狀分布有利于血管內(nèi)皮細(xì)胞彼此間連接，最終形成血管，這是否能成為內(nèi)皮細(xì)胞系細(xì)胞區(qū)別于其他細(xì)胞的一個生長特征，值得筆者進一步研究。

實驗中筆者還發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)時間的EPCs形態(tài)差別較大，單靠形態(tài)難以鑒定EPCs。目前，EPCs的鑒定仍然要通過表面標(biāo)志物檢測，常以CD34、CD133、血管內(nèi)皮生長因子受體2和Ⅷ因子作為識別EPCs的重要表型特征，具備上述表型特征的細(xì)胞方被認(rèn)為是EPCs[6]。CD34是造血干細(xì)胞的重要標(biāo)志，在胚胎早期血管就有表達(dá)，外周血中分離出的CD34陽性細(xì)胞在體外能夠向內(nèi)皮細(xì)胞分化在體內(nèi)能夠參與新生血管形成，因此常被用作識別EPCs的重要標(biāo)志[7]。近年，更多研究表明，CD133能表達(dá)于EPCs上，是一種比CD34更有價值的EPCs表面標(biāo)志，而且CD133在EPCs的分化過程中迅速下調(diào)，但在成熟內(nèi)皮細(xì)胞則無表達(dá)，這使越來越多的學(xué)者樂于采用CD133來分離EPCs，并成為排除成熟內(nèi)皮細(xì)胞的EPCs的細(xì)胞標(biāo)記，進而成為分離EPCs的最常用細(xì)胞表面標(biāo)志[8]。

本研究中，筆者采用設(shè)立陰性對照的方法，對培養(yǎng)第7天的貼壁細(xì)胞進行免疫組化檢測。結(jié)果顯示，培養(yǎng)細(xì)胞的CD34、CD133、VEGFR-2和Ⅷ因子的幾項檢測指標(biāo)在對照組為陰性，在試驗組均呈陽性，表明筆者培養(yǎng)的細(xì)胞為EPCs。

綜上所述，本研究初步建立了一種人外周血EPCs的分離、培養(yǎng)方法，可避免人外周血EPCs較少，提取大量細(xì)胞困難的缺點，為后續(xù)實驗研究提供充足的EPCs。

[參考文獻]

[1]Singh AK，Gudehithlu KP，Patri S，et al.Impaired integration of endothelial progenitor cells in capillaries of diabetic wounds is reversible with vascular endothelial growth factor infusion[J]. Trans Res，2007，149 （5）：282-291.

[2]Chen ZZ，Jiang XD， Zhang LL，et al.Beneficial effect of autologous transplantation of bone m arrow stromal cells and endothelial progenitor cells on cerebral ischemia in rabbits[J].Neurosci Lett，2008，445（1）：36-41.

[3]Zhu C，Ying D，Mi J，et al.Development of anti-atherosclerotic tissue-engineered blood vessel by A20-regulated endothelial progenitor cells seeding decellularized vascular matrix. Biomaterials[J].Biomaterials，2008，29（17）：2628-2636.

[4]Asahara T，Mumhara T，Suilivan A，et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesi[J].Science，1997，275（5302）：964-967.

[5]Boyer M，Townsend LE，Vogel LM，et al.Isolation of endothelial cells and their progenitor cells from human peripheral blood[J].J Vasc Surg，2000，31（1）：181-189.

[6]Liu P，Zhou B，Gu D，et a.l.Endothelial progenitor cell therapy in atherosclerosis： a double-edged sword[J].Ageing Res Rev，2009，8（2）：83-93.

[7]Devanesan AJ，Laughlan KA，Girn HR，et a.l.Endothelial progenitor cells as a therapeutic option in peripheral arterial disease[J].Eur J Vasc Endovasc Surg， 2009，38（4）： 478-481.

[8]Fadini GP，Coracina A，Baesso I，et al. Peripheral blood CD34+KDR+ endothelial progenitor cells are determinants of subclinical atherosclerosis in a middle-aged general population[J].S troke，2006，37（9）：2277-2282.

[收稿日期]2012-04-09 [修回日期]2012-06-25

編輯/張惠娟