創(chuàng)愈生肌散對(duì)糖尿病大鼠模型慢性創(chuàng)面的治療作用研究

張子茜等

[摘要]目的：觀察以中藥傳統(tǒng)方劑生肌散為基礎(chǔ)的改良新藥創(chuàng)愈生肌散對(duì)糖尿病大鼠模型慢性難愈創(chuàng)面的治療作用。方法：對(duì)糖尿病大鼠模型慢性難愈創(chuàng)面經(jīng)隨機(jī)分組后給予外用創(chuàng)愈生肌散和rb-bFGF，以未作處理的創(chuàng)面作為空白對(duì)照。分別在傷后第1、4、7、10、14和21天觀察各組慢性難愈創(chuàng)面的愈合情況，使用Real time PCR方法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)慢性難愈創(chuàng)面中VEGF、HIF-1α以及Ang1基因的表達(dá)情況。結(jié)果：在糖尿病性慢性難愈創(chuàng)面模型中，創(chuàng)愈生肌散組糖尿病性慢性難愈創(chuàng)面的愈合時(shí)間為（21.3±2.1）天，rb-bFGF組創(chuàng)面的愈合時(shí)間為（23.2±2.4）天，對(duì)照組創(chuàng)面的愈合時(shí)間為（26.8±2.8）天，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。使用Real time PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)愈生肌散組的創(chuàng)面標(biāo)本中的VEGF、HIF-1α以及Ang1表達(dá)量明顯高于其他兩組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：使用創(chuàng)愈生肌散可明顯縮短糖尿病性慢性難愈創(chuàng)面的愈合時(shí)間，創(chuàng)愈生肌散可通過上調(diào)VEGF、HIF-1α以及Ang1等與新生血管密切相關(guān)的基因表達(dá)而促進(jìn)創(chuàng)面中的血管生成。

[關(guān)鍵詞]創(chuàng)愈生肌散；大鼠；糖尿?。宦噪y愈創(chuàng)面

[中圖分類號(hào)]R622R332[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2012）08-1334-03

創(chuàng)面是正常皮膚組織在外界致傷因素及機(jī)體內(nèi)在因素如營養(yǎng)不良、缺氧和感染等作用所導(dǎo)致的損害，表現(xiàn)為破壞皮膚完整性及丟失正常組織形態(tài)及功能。通常將4～6周不愈合的創(chuàng)面稱為慢性難愈創(chuàng)面，大多需要長(zhǎng)時(shí)間的治療，每年創(chuàng)面處理的醫(yī)療費(fèi)非常高。伴隨我國人民生活水平提高和人口逐步老齡化，糖尿病的發(fā)病率逐年上升，伴隨而來的糖尿病性慢性創(chuàng)面的發(fā)生率越來越高，除了影響患者生活質(zhì)量，治療不及時(shí)的慢性創(chuàng)面經(jīng)常致殘、致畸[1-2]。大量實(shí)驗(yàn)已證明慢性難愈創(chuàng)面愈合的核心問題之一是局部血運(yùn)不良，創(chuàng)面愈合血管化延遲，因此，尋找促進(jìn)創(chuàng)面愈合的血管化的新藥十分必要[3]。目前臨床上使用各類生長(zhǎng)因子，但是臨床試用效果并不理想，且存在價(jià)格昂貴、半衰期短、基因治療的不成熟性等問題。然而，千百年來，祖國醫(yī)學(xué)的中藥外用對(duì)創(chuàng)面愈合卻具有獨(dú)特療效。因此，充分發(fā)揮外用中藥有效促進(jìn)創(chuàng)面愈合的特長(zhǎng)，系統(tǒng)研究藥物作用機(jī)理具有重要的意義。

創(chuàng)愈生肌散是由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院根據(jù)中藥傳統(tǒng)方劑生肌散改良而來的新型中成藥制劑，該藥物在藥理上具有止血、消腫、消炎、促進(jìn)傷口愈合，治療各種燒燙傷、外傷有效的方法功效，在對(duì)犬的大、中、小型切口模型中，創(chuàng)愈生肌散能明顯縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間，降低創(chuàng)面感染率，促進(jìn)愈合[4-5]。

為了研究創(chuàng)愈生肌散對(duì)慢性難愈創(chuàng)面的治療功效和相關(guān)機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建糖尿病慢性難愈創(chuàng)面動(dòng)物模型，與rb-bFGF和空白對(duì)照相比，觀察使用創(chuàng)愈生肌散后慢性難愈創(chuàng)面動(dòng)物模型的創(chuàng)面愈合情況。并且采用分子生物學(xué)的方法，檢測(cè)血管形成及相關(guān)分子的表達(dá)，深入探討創(chuàng)愈生肌散促進(jìn)慢性難愈性創(chuàng)面愈合血管化的分子機(jī)制。

1材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑：本實(shí)驗(yàn)使用SD大鼠均為雄性，8～10周齡，150～200g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。Real time PCR試劑盒為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；VEGF單抗、HIF-1α單抗和Ang-1單抗為武漢博士德公司產(chǎn)品；rb-bFGF為珠海億勝生物制藥有限公司產(chǎn)品。

1.2 Ⅱ型糖尿病大鼠模型的構(gòu)建： 54只SD大鼠均喂以高糖高脂飼料，配方為基礎(chǔ)飼料66.5%、蔗糖20%、豬油10%、膽固醇2.5%、膽酸鹽1%、奶粉4%、雞蛋1.5%；饑餓12h（過夜禁食，不禁水）后，按照40mg/kg體重的比例，從尾靜脈注射pH4.5、0.1mol/L檸檬酸緩沖液配制的1%鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）；實(shí)驗(yàn)過程中檢測(cè)各組隨機(jī)血糖及空腹血糖、葡萄糖耐量；于造模第4周和第8周對(duì)所有的大鼠行葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)；糖尿病大鼠模型建成標(biāo)準(zhǔn)為：大鼠禁食12 后以50%葡萄糖溶液灌胃后血糖峰值16.7mol/L、120min血糖達(dá)到11.1mmol/L、且體重明顯下降（>50g）。

1.3 慢性難愈性創(chuàng)面的構(gòu)建：將確認(rèn)建模成功的SD大鼠使用鹽酸戊巴比妥鈉（100mg/kg）腹腔注射麻醉；腰椎正中偏上剪毛并在造模區(qū)標(biāo)記相同的2cm×2cm的造模面積；在無菌條件下，沿脊椎方向用外科方法作切取全等皮膚，建立全層皮膚缺損開放性創(chuàng)面模型；創(chuàng)面加蓋兩層消毒干紗布，醫(yī)用膠布固定，造模后每只大鼠連續(xù)3天后肢肌肉注射青霉素40萬U預(yù)防感染。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及藥物使用：SD大鼠54只，按照體重隨機(jī)分為3組：創(chuàng)愈生肌散組、rb-bFGF組以及空白對(duì)照組各18只；創(chuàng)愈生肌散組SD大鼠每日創(chuàng)面消毒后，生理鹽水沖洗創(chuàng)面，創(chuàng)愈生肌散（第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科，蘭制字2006F68129）1g直接敷于創(chuàng)面，每日兩次； rb-bFGF組SD大鼠創(chuàng)面每日消毒后，生理鹽水沖洗后，按150AU/cm2劑量將藥物直接噴于創(chuàng)面，表面紗布包扎固定，每日兩次；對(duì)照組：創(chuàng)面清創(chuàng)消毒后，每日換藥兩次，不給于任何藥物；分別于術(shù)后1、4、7、10、14、21天觀察記錄各組大鼠的創(chuàng)面愈合情況，計(jì)算局部創(chuàng)面愈合率，并處死大鼠，并以每個(gè)創(chuàng)面為中心，切取2.2cm×2.2cm大小組織（含全部創(chuàng)面）用于實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。

1.6 Real time PCR檢測(cè)：按照TaKaRa公司Real time PCR檢測(cè)試劑盒操作說明進(jìn)行，在ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0，以方差分析檢驗(yàn)各組均數(shù)問的差異，如果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，S-N-K檢驗(yàn)進(jìn)一步行多重比較。

2結(jié)果

3討論

本研究利用鏈脲左菌素實(shí)驗(yàn)性糖尿病動(dòng)物模型用于模仿糖尿病慢性難愈創(chuàng)面，雖然轉(zhuǎn)基因型和自發(fā)型糖尿病模型已應(yīng)用于研究領(lǐng)域，但是來源較少，飼養(yǎng)條件高、價(jià)格昂貴，難于大規(guī)模的廣泛普及應(yīng)用。目前鏈脲左菌素實(shí)驗(yàn)性糖尿病動(dòng)物模型是應(yīng)用最為廣泛的實(shí)驗(yàn)性糖尿病動(dòng)物模型，具有技術(shù)成熟、成功率高和成本低等優(yōu)點(diǎn)。利用該模型構(gòu)建糖尿病性慢性難愈創(chuàng)面，并分別給予創(chuàng)愈生肌散和rb-bFGF，觀察兩種藥物對(duì)創(chuàng)面愈合的影響。并且使用分子生物學(xué)方法檢測(cè)創(chuàng)面標(biāo)本中VEGF、HIF-1α和Ang1的表達(dá)以及微血管密度。

經(jīng)過觀察，創(chuàng)愈生肌散組糖尿病性慢性難愈創(chuàng)面的愈合時(shí)間與rb-bFGF組和對(duì)照組相比明顯縮短，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。通過計(jì)算創(chuàng)面愈合率發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)愈生肌散組的糖尿病性慢性難愈創(chuàng)面的愈合率明顯高于其他兩組，說明使用創(chuàng)愈生肌散可明顯促進(jìn)糖尿病性慢性難愈創(chuàng)面的愈合。Real time PCR和免疫組織化學(xué)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病性慢性難愈創(chuàng)面給藥后第1天、4天、7天和10天，創(chuàng)愈生肌散組難愈創(chuàng)面標(biāo)本中的VEGF、HIF-1α和Ang1的表達(dá)明顯高于rb-bFGF組和對(duì)照組，而第14天和21天三組之間則無明顯差異。說明創(chuàng)愈生肌散有明顯的上調(diào)VEGF、HIF-1α和Ang1表達(dá)的作用。以上結(jié)果說明創(chuàng)愈生肌散可通過上調(diào)與新生血管關(guān)系密切的基因表達(dá)如VEGF、HIF-1α和Ang1促進(jìn)糖尿病性慢性難愈創(chuàng)面中的血管發(fā)生，進(jìn)而加速糖尿病性慢性難愈創(chuàng)面的愈合。本研究結(jié)果將為臨床廣泛應(yīng)用生肌類中藥提供理論依據(jù)，也能夠?yàn)榻窈笱芯恐形麽t(yī)結(jié)合的治療方法提供方向，并將會(huì)促進(jìn)祖國傳統(tǒng)中醫(yī)藥在國際上的競(jìng)爭(zhēng)力。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Baumgartner M，Tanner D，Hunziker T.Local treatment of chronic skin wounds in a Swiss out-patient wound centre 2010[J].Ther Umsch，2011，68：153-158.

[2]Gualdi G，Monari P，F(xiàn)arisoglio C，et al. Nested graft in chronic wounds： a new solution for an old problem[J].Int Wound J，2011，8：127-31.

[3]Percival SL， Hill KE， Malic S，et al. Antimicrobial tolerance and the significance of persister cells in recalcitrant chronic wound biofilms[J].Wound Repair Regen， 2011，19：1-9.

[4]劉玉林，孫志峰，劉子冬，等.創(chuàng)愈生肌散促進(jìn)全創(chuàng)傷愈合效果的藥效研究[J].陜西中醫(yī)，2009，30（7）：918-919.

[5]王芳，李雪晴，劉玉林，等.創(chuàng)愈生肌散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30（1）：80-81.

[6]Lerman OZ， Galiano RD， Armour M，et al.Cellular dysfunction in the diabetic fibroblast： impairment in migration，vascular endothelial growth factor production， and response to hypoxia[J].Am J Pathol，2003，162：303-312.

[7]Catrina SB，Okamoto K，Pereira T，et al.Hyperglycemia regulates hypoxia-inducible factor-1α protein stability and function[J].Diabetes，2004，53：3226-3232.

[8]Brem H，Tomic-Canic M，Entero H，et al.The synergism of age and db/db genotype impairs wound healing[J].Exp Gerontol，2007，42：523-531.

[9]Botusan IR，Sunkari VG，Savu O，et al.Stabilization of HIF-1α is critical to improve wound healing in diabetic mice[J].Proc Natl Acad Sci USA，2008，105：19426-19431.

[10]Wang GL，Semenza GL.General involvement of hypoxia-inducible factor 1 in transcriptional response to hypoxia[J].Proc Natl Acad Sci U S A. 1993；90：4304-4308.

[11]Mace KA， Yu DH， Paydar KZ，et al.Sustained expression of HIF-1α in the diabetic environment promotes angiogenesis and cutaneous wound repair[J].Wound Repair Regen，2007，15：636-645.

[12]Gregg L.Semenza. Vascular Responses to Hypoxia and Ischemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010，30（4）：648-652.

[收稿日期]2012-04-11[修回日期]2012-06-28

編輯/張惠娟