李 冰，董征英，常維山

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271018）

黃曲霉毒素（AF）是由黃曲霉、寄生曲霉等幾種真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，是一類結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)相似的分子真菌毒素，是一種毒物和強(qiáng)致癌物質(zhì)，AFB1是迄今發(fā)現(xiàn)的各種真菌毒素中最穩(wěn)定的一種[1-2]。黃曲霉毒素存在廣泛、危害巨大，畜禽食入被污染的飼料會(huì)降低動(dòng)物的生產(chǎn)性能、引發(fā)一系列疾病，可間接通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體并具有極強(qiáng)的致癌作用，嚴(yán)重威脅人類健康[3]。

目前在糧食和飼料的貯藏過(guò)程中不可避免產(chǎn)生霉菌毒素，解決霉毒素尤其是AFB1對(duì)糧食和飼料的污染是一個(gè)世界性難題。傳統(tǒng)去除AFB1的方法主要有吸附、萃取、熱處理、射線處理、酸堿處理、氧化還原處理，但是有費(fèi)時(shí)費(fèi)力、去毒率不高、易造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失的缺點(diǎn)。目前發(fā)現(xiàn)自然界中有多種微生物能吸附或降解飼料或食品中的黃曲霉毒素，這些微生物包括細(xì)菌、酵母菌′、霉菌、放線菌和藻類等。采用微生物或其產(chǎn)生酶進(jìn)行脫毒不僅條件相對(duì)溫和，不會(huì)破壞產(chǎn)品的品質(zhì)，而且有些還能增加產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[4]。其中黑曲霉在降解AFB1方面不僅表現(xiàn)出了高效、經(jīng)濟(jì)、安全等優(yōu)點(diǎn)，還會(huì)抑制飼料中黃曲霉的生長(zhǎng)和提高飼料利用率的優(yōu)勢(shì)。因此，研究開發(fā)利用黑曲霉來(lái)進(jìn)行AFB1的生物脫毒具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

黑曲霉購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，瓊脂20 g·L-1；PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1。

1.3 試驗(yàn)試劑與設(shè)備

AFB1標(biāo)準(zhǔn)品（以色列Fermentek公司生產(chǎn)）用乙腈配制成1 mg·mL-1備用。試驗(yàn)設(shè)備包括高效液相色譜儀、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、冷凍離心機(jī)等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 黑曲霉對(duì)AFB1的降解作用

將黑曲霉接入50 mL PDB培養(yǎng)基中，于37℃、150 rpm，搖床培養(yǎng)2 d，然后加入1 mg·mL-1AFB15μL，3 d后檢測(cè)AFB1含量；用只含AFB1的PDB培養(yǎng)基作為對(duì)照組。

2.2 降解曲線的測(cè)定

將黑曲霉和1 mg·mL-1AFB15μL接入100 mL PDB培養(yǎng)基中。每隔3 h測(cè)定1次毒素降解率，連續(xù)測(cè)定15 h。

2.3 黑曲霉降解AFB1活性組分的確定

將黑曲霉接入100 mL PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d。取發(fā)酵液50 mL，在4℃、8 000 rpm條件下冷凍離心20 min，分離上清液與菌體細(xì)胞，取上清液，即得胞外粗提液；將沉淀的菌體細(xì)胞用蒸餾水連續(xù)洗滌兩次，用蒸餾水35 mL溶解備用；同上再制備1份菌體細(xì)胞，對(duì)菌體細(xì)胞溶液進(jìn)行細(xì)胞超聲波破碎后冷凍離心，將離心后的上清液用孔徑為0.2μm的過(guò)濾膜過(guò)濾，然后溶于蒸餾水35 mL制成胞內(nèi)液，備用。分別在等量的黑曲霉菌體細(xì)胞溶液、胞內(nèi)物質(zhì)、胞外粗提液中加入AFB12μm，在37℃的培養(yǎng)箱中反應(yīng)2 d；以等量的蒸餾水加AFB1為對(duì)照組。

2.4 黃曲霉毒素降解菌株的應(yīng)用

2.4.1 急性毒理學(xué)試驗(yàn)

將黑曲霉接入100 mL PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d。發(fā)酵液對(duì)5只小鼠（雌雄各半）進(jìn)行最大耐受試驗(yàn)，每次最大給藥量為0.2 mL·只-1·10 g-1，灌胃給藥3次·d-1，24 h后觀察小鼠表現(xiàn)；對(duì)5只小鼠經(jīng)口灌胃蒸餾水作為對(duì)照組。

2.4.2 發(fā)霉飼料中黃曲霉毒素降解試驗(yàn)

取飼料500 g和蒸餾水200 mL充分混勻，在37℃的恒溫箱中放置21 d制得發(fā)霉飼料。取黑曲霉發(fā)酵液50 mL和發(fā)霉飼料混勻，在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，每隔12 h充分混勻1次。檢測(cè)對(duì)比發(fā)霉飼料中發(fā)酵前后AFB1的含量。

2.5 AFB1的提取與檢測(cè)

AFB1的提取參照GB/T8381-2008/ISO6651：2001。AFB1的檢測(cè)采用三氟乙酸柱前衍生后HPLC檢測(cè)方法。

HPLC檢測(cè)條件為流動(dòng)相乙腈∶水=3∶7；流速1 mL·min-1；色譜柱C18 4.6 mm×250 mm，0.5 μL；柱溫為室溫；激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)440 nm；進(jìn)樣量20μL。AFB1降解率的計(jì)算公式見式1。

3 結(jié)果與分析

3.1 AFB1標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖

AFB1標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖見圖1。

圖1 AFB1標(biāo)準(zhǔn)品的色譜

由圖1可以看出，AFB1的保留時(shí)間為11.30 min。

3.2 黑曲霉對(duì)AFB1的降解：

黑曲霉對(duì)AFB1的降解見圖2～3。

由圖2～3可以看出，代表AFB1的色譜峰顯著減小（P＜0.05）。HPLC檢測(cè)計(jì)算得出黑曲霉對(duì)AFB1降解率達(dá)93.28%。在相同培養(yǎng)基中有無(wú)黑曲霉對(duì)AFB1含量的變化表明，該降解完全是由黑曲霉的生長(zhǎng)引起的，與PDB培養(yǎng)基的吸附作用無(wú)關(guān)。

圖2 對(duì)照組色譜圖

圖3 試驗(yàn)組色譜圖

3.3 降解曲線的測(cè)定

黑曲霉不同時(shí)間對(duì)菌株毒素降解率的影響結(jié)果見圖4。由圖4可見，在前12 h內(nèi)，AFB1的降解率升高很快，可能與菌體吸附有關(guān)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，AFB1的降解率升高幅度減慢，可能主要由黑曲霉產(chǎn)生的活性物質(zhì)作用所致。

圖4 黑曲霉對(duì)AFB1的降解曲線

3.4 黑曲霉降解AFB1活性組分的確定

對(duì)照組（含AFB1的蒸餾水）的色譜圖、胞內(nèi)物質(zhì)對(duì)AFB1降解后的色譜圖、菌體細(xì)胞對(duì)AFB1降解后的色譜圖、胞外粗提液對(duì)AFB1降解后的色譜圖分別見圖5～9。

圖5 對(duì)照組（含AFB1的蒸餾水）色譜圖

圖6 胞內(nèi)物質(zhì)對(duì)AFB1降解后色譜圖

圖7 菌體細(xì)胞對(duì)AFB1降解后色譜圖

圖8 胞外粗提液對(duì)AFB1降解后色譜圖

圖9 黑曲霉的不同處理對(duì)降解AFB1的結(jié)果

由圖5～9可以看出，胞外粗提液AFB1降解能力最強(qiáng)，降解率達(dá)到84.20%，菌體細(xì)胞的降解能力次之，降解率達(dá)到38.40%，胞內(nèi)物質(zhì)的降解能力最差，降解率為3.33%，基本無(wú)降解能力。黑曲霉菌體細(xì)胞對(duì)樣品中AFB1的消除可能是運(yùn)用細(xì)胞壁的物理吸附作用，胞內(nèi)物質(zhì)、胞外粗提液是運(yùn)用生物學(xué)方法來(lái)解毒，主要通過(guò)轉(zhuǎn)化AFB1的結(jié)構(gòu)來(lái)達(dá)到降解作用。從HPLC的結(jié)果來(lái)看，胞外粗提液降解AFB1后，其產(chǎn)物的特征熒光顯著減弱，推測(cè)是一種酶裂解了內(nèi)酯環(huán)。由此可以認(rèn)為，黑曲霉降解AFB1起作用的主要是胞外粗提液中的一種生物活性酶，黑曲霉對(duì)AFB1的降解過(guò)程實(shí)質(zhì)上應(yīng)是降解酶的酶促反應(yīng)。

3.5 黑曲霉發(fā)酵液對(duì)發(fā)霉飼料的作用

黑曲霉發(fā)酵液對(duì)發(fā)霉飼料的作用見圖10～11。

圖10 霉變飼料處理前的色譜

由圖10可以看出，霉變飼料中有大量熒光物質(zhì)，包括AFB1。由圖11可以看出，霉變飼料中的很多熒光物質(zhì)被降解，AFB1已接近0。經(jīng)過(guò)黑曲霉發(fā)酵液對(duì)發(fā)霉飼料的處理，其中AFB1的含量遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中飼料AFB1的超標(biāo)量（≤10 μg·kg-1）[5]。黑曲霉及其產(chǎn)生的活性物質(zhì)降解其中AFB1作用效果溫和，安全性高，不影響原有品質(zhì)，而且具有操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，適合在飼料方面規(guī)模應(yīng)用。

圖11 霉變飼料處理后的色譜

3.6 急性毒性試驗(yàn)

經(jīng)觀察，灌服小鼠無(wú)死亡現(xiàn)象，也未出現(xiàn)任何中毒現(xiàn)象。3 d后處死小鼠，解剖觀察其心、肝、脾、肺、腎，均無(wú)特殊改變。小鼠最大耐受量的測(cè)定主要考察小鼠在藥物單次給藥或24 h內(nèi)多次給藥后的急性毒性情況，可對(duì)黑曲霉發(fā)酵液的安全性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)[6]?？梢姶朔N黑曲霉對(duì)小鼠并無(wú)顯著的急性毒副作用。黑曲霉在國(guó)際上公認(rèn)安全性高，已在食品及飼料發(fā)酵的生產(chǎn)中廣泛使用。因此，可以認(rèn)為采用的微生物降解AFB1工藝在安全性方面無(wú)需擔(dān)心。

4 討論

黃曲霉毒素自從20世紀(jì)60年代被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，人們對(duì)其危害越來(lái)越重視，雖然已研發(fā)、推廣了一些脫毒或降解毒素的方法，但都有弊端。近年來(lái)，人們希望用簡(jiǎn)單、便捷、溫和的方法來(lái)去除黃曲霉毒素，紛紛把研究重點(diǎn)向微生物降解方面發(fā)展。從國(guó)際上的報(bào)道來(lái)看，霉菌毒素的微生物降解研究有了很大進(jìn)展，尤其是黃曲霉毒素去除的研究，但仍存在一些問題，例如微生物的降解過(guò)程緩慢，安全性不確定，有效組分解毒酶的復(fù)雜性，這些因素限制了在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用[7-14]?，F(xiàn)在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用的多是菌體的吸附作用（啤酒酵母、乳酸菌等對(duì)毒素的吸附），研究證明，主要是菌體細(xì)胞壁與黃曲霉毒素通過(guò)非共價(jià)方式結(jié)合的，這種吸附作用沒有達(dá)到真正去除AFB1的目的。微生物降解霉菌毒素不同于物理吸附，降解是霉菌毒素分子的毒性基團(tuán)被微生物產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物或者所分泌的胞內(nèi)、胞外酶分解破壞，同時(shí)產(chǎn)生無(wú)毒的降解產(chǎn)物的過(guò)程[15]。孫豐芹等利用營(yíng)養(yǎng)特異性方法進(jìn)行去除AFB1菌株的初篩，之后將初篩的7株菌細(xì)胞和發(fā)酵上清液作用于質(zhì)量濃度為200 μg·L-1的AFB1，結(jié)果表明，篩選得到的TRS-3菌株，其活細(xì)胞和死細(xì)胞對(duì)AFB1的去除率分別達(dá)到48.26%和53.56%，其發(fā)酵上清液降解AFB1的能力達(dá)到78.55%，均高于其他菌株，從花生土壤和花生粕中也篩選出能去除黃曲霉毒素B1（AFB1）的菌株[16]。

高效液相色譜法是當(dāng)前國(guó)際上使用權(quán)威的檢測(cè)AFB1方法，因此本研究采用高效液相色譜法對(duì)AFB1進(jìn)行檢測(cè)，為了加強(qiáng)熒光，通過(guò)強(qiáng)氧化劑三氟乙酸柱前進(jìn)行衍生處理[17]。經(jīng)過(guò)高效液相色譜的檢測(cè)，表明黑曲霉及產(chǎn)生的活性物質(zhì)能夠很好的降解AFB1，而且菌體能夠吸附一定量的AFB1。另外，徐丹等還發(fā)現(xiàn)黑曲霉能有效抑制黃曲霉的生長(zhǎng)與繁殖，從而達(dá)到抑制黃曲霉產(chǎn)毒的作用[18]。由此可見，黑曲霉不僅能夠產(chǎn)生活性物質(zhì)降解AFB1，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生抑制黃曲霉生長(zhǎng)和繁殖的物質(zhì)，這在防霉去霉過(guò)程中有很大的作用，也對(duì)以后開發(fā)研制高效、廣譜、無(wú)毒的天然防霉劑和生物降解劑提供理論基礎(chǔ)。

5 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)有益菌株的篩選，得到降解AFB1效果最佳的一種黑曲霉，其對(duì)AFB1的降解率達(dá)93.28%，起降解作用的主要是一種生物活性酶，且菌體細(xì)胞對(duì)AFB1也有一定的吸附作用，從小鼠的急性毒性試驗(yàn)和發(fā)霉飼料中霉菌毒素的降解來(lái)看，黑曲霉及其產(chǎn)生的活性物質(zhì)對(duì)AFB1生物降解作用效果溫和，安全性高，不影響原有品質(zhì)，而且具有操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，運(yùn)用在飼料中降解霉菌毒素有很大的開發(fā)潛力。

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