李婷婷，陳 斌，陳省平，劉 翠，姚 雪，陳偉洲，賴學文，劉 濤

(1.中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島 266003；2.中山大學中山醫(yī)學院，廣東 廣州510080；3.汕頭大學，廣東 汕頭 515063；4.汕頭市水產(chǎn)研究所，廣東 汕頭 515000)

江蘺科Gracilariaceae在自然分類系統(tǒng)上屬于紅藻門Rhodophyta江蘺目Gracilariales，包括江蘺屬Gracilaria、龍須菜屬Gracilariopsis、蘺生藻屬Gracilariophila、Hydropuntia、Curdiea、Melanthalia和Congracilaria7個屬。在紅藻門中，江蘺科無論是解剖學層面[1-3]還是分子學層面[4-6]，都是很明確的一個科，但是因缺乏足夠多的形態(tài)學和生殖結構特征，其屬間種間存在著復雜的分類關系[7-10]。在過去的20年里，分子生物學技術不斷的應用到江蘺科分類研究中，揭示江蘺科種水平上的系統(tǒng)發(fā)生關系。目前江蘺科分子系統(tǒng)學研究多采用18S rDNA[10-11]、Rubisco spacer[11-13]、ITS(internal transcribed spacer)[10，12，14]、rbcL[15-18]、cox2-3[13，19]和psbA[16]等序列。

ITS序列包括ITS1和ITS2，是分別介于18S與 5.8S、5.8S 與28S rDNA之間的非編碼序列,呈ITS1-5.8S-ITS2結構(本文將ITS1-5.8S -ITS2簡稱為ITS)。此結構中5.8S 是高度保守的基因序列，而ITS1和ITS2是進化速度較快的序列，利用ITS序列可以從不同分類水平上探討系統(tǒng)進化關系。本文通過對來自江蘺屬和龍須菜屬總5個物種23個種群的ITS序列進行擴增，并與GenBank中江蘺科海藻ITS序列進行比對分析，從分子水平上闡明江蘺科海藻系統(tǒng)發(fā)育和種群水平的遺傳變異，為江蘺科海藻的分類和鑒定提供更多數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用江蘺科海藻5個物種23個群體由中國海洋大學大型海藻種質(zhì)庫提供(見表1)。每個群體選取2～3株個體進行實驗，總66株實驗材料。

表1 實驗材料信息1)

1.2 實驗方法

1.2.1 總DNA提取 總DNA提取采用改進的CTAB法[20]。所提取DNA用w=1％瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，使用NanoDrop ND-1000儀器，測定A260/A280、A260/A230比值，對DNA濃度和純度進行質(zhì)量評價，并將DNA模板濃度統(tǒng)一調(diào)整到50 ng/μL。

1.2.2 PCR擴增 用于ITS序列擴增的引物為TW81：5’-GGGATCCGTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3’；AB28：5’-GGGATCCATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3’[21]，引物由上海博尚生物技術有限公司合成。PCR反應體系為25 μL，反應體系：ddH2O 16.8 μL，10×Buffer 2.5 μL， MgCl2(25 mmol/L) 2.3 μL，dNTP 2.0 μL，正反引物(10 μmol/L)各0.1 μL，DNA模板 (50 ng/μL) 1.0 μL，Taq DNA 聚合酶 (5 U/μL) 0.2 μL。PCR擴增程序：94 ℃預處理6 min后， 94 ℃變性1 min，51 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，總35個循環(huán)，最后在72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.3 PCR產(chǎn)物純化、克隆及測序 PCR產(chǎn)物用TIANgel Midi Purification Kit 試劑盒(北京天根生化科技有限公司)膠回收純化后與pMD19-T載體(TaKaRa 寶生物工程有限公司)連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coliTOP 10(北京天根生化科技有限公司)中，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選，每份PCR產(chǎn)物挑取3個陽性克隆進行擴大培養(yǎng)，菌液PCR擴增并利用w=1％瓊脂糖凝膠電泳檢測插入片段大小，委托上海英駿生物技術有限公司公司進行雙向測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 利用SeqMan 7.1.0軟件對測序數(shù)據(jù)進行拼接和質(zhì)量矯正，并與GenBank中下載到的江蘺科16個物種的19條ITS全長序列進行對比分析，選擇長心卡帕藻Kappaphycusalvarezii(GQ869849)作為外群(GenBank獲取號以及詳細信息見表1和表2)。用MEGA 4.0計算其堿基含量和變異位點，并選擇Kimura 2-parameter和Complete Deletion計算遺傳距離。選擇不同物種和不同地理種群的序列用ClustalX 1.83軟件進行序列比對，用PAUP 4.0 軟件在Modeltest 3.7中計算不同核酸替代模型的似然值并篩選出最適核酸替換模型，最終按Akatke Information Criterion(AIC)結果得到的最適核酸替換模型為GTR+I+G(參數(shù)：Base frequencies：A=0.268 6，C=0.170 8，G=0.237 2，T=0.323 4；substitution rate matrix: A-C=1.19 8，A-G=2.385 8，A-T=1.334 1，C-G=1.143 2，C-T=2.868 0，G-T=1.000 0；proportion of invariable sites=0.093 0，gamma parameter=2.510 4)，利用以上數(shù)據(jù)在PAUP4.0中依據(jù)鄰接法(Neighbor joining，NJ)和最大似然法(Maximum likelihood，ML)構建系統(tǒng)樹，自舉值Bootstrap為1 000次重復。依據(jù)最大簡約法(Maximum parsimony，MP)構建系統(tǒng)樹時在PAUP 4.0中采用啟發(fā)式搜索(Heuristic search)的逐步加入式算法(Stepwise addition)分支交換法(Branch swapping algorithm)設定為樹二等分再連接算法(Tree bisection reconnection，TBR)，每輪搜索最大嘗試次數(shù)為1 000次， 每步保留20個樹，自舉值Bootstrap為1 000次重復。

2 結果與分析

2.1 ITS序列長度和GC含量分析

ITS序列長度和GC含量分析結果見表2。江蘺科海藻ITS存在較為豐富的長度變異，長度在893～1 508 bp之間，其中龍須菜屬龍須菜Gp.lemaneiformis和Gp.tenuifrons的ITS序列長度較其他物種短，分別為1 065(1 066) bp和893 bp；江蘺科海藻ITS1序列長度在121～568 bp之間，ITS2序列長度在585～984 bp之間，同一物種的ITS2序列明顯長于ITS1序列，且其GC含量明顯高于ITS1序列。

相比ITS1和ITS2序列，江蘺科海藻的5.8S序列長度較為穩(wěn)定，除無管籬生藻Gp.oryzoides、細基江蘺G.tenuistipitata和智利江蘺G.chliensis3個物種外，其他物種5.8S序列長度均為159 bp；5.8S序列GC含量也明顯高于ITS1和ITS2序列的GC含量。細基江蘺G.tenuistipitata5.8S序列為139 bp，在60 bp位點后缺失19個堿基，在114 bp處缺失一個堿基；智利江蘺G.chliensis5.8S序列為140 bp，在60 bp位點后缺失19個堿基；蘺生藻屬無管籬生藻Gp.oryzoides的5.8S序列長162 bp，在102位點之后增加了3個T堿基(見圖1)。

表2 江蘺科物種ITS序列長度及堿基組成1)

圖1 江蘺科海藻5.8S核苷酸序列比對

2.2 ITS序列比對分析

對所有江蘺科的ITS 序列用MEGA 4.0進行比對，比對后序列長度為1 781 bp(including gaps)，計算遺傳距離結果顯示，江蘺科各屬內(nèi)的種間遺傳距離明顯大于種內(nèi)遺傳距離(見表3)。江蘺屬各物種的種內(nèi)遺傳距離在0.000～0.012之間，存在0～36個變異位點；細基江蘺繁枝變種和細基江蘺G.tenuistipitata種間遺傳距離為0.004，存在25個變異位點，包括了14個種間區(qū)分位點；江蘺屬其他物種的種間遺傳距離在0.041～0.411之間，存在111～611個變異位點。龍須菜屬的種內(nèi)遺傳距離為0.000，龍須菜和Gp.tenuifrons種間遺傳距離為0.382。Hydropuntia中H.caudata種內(nèi)遺傳距離為0.009，存在14個變異位點；H.caudata和H.crassissima種間遺傳距離為0.128，存在252個變異位點。江蘺屬與龍須菜屬物種間的遺傳距離在0.401～0.554之間。江蘺屬與Hydropuntia物種間的遺傳距離在0.193～0.409之間。江蘺屬與籬生藻屬物種間的遺傳距離在0.527～0.600之間。龍須菜屬與Hydropuntia物種間的遺傳距離在0.382～0.535之間。龍須菜屬與籬生藻屬物種間的遺傳距離在0.267～0.406之間。Hydropuntia與籬生藻屬物種間的遺傳距離在0.533～0.578之間。

在本文研究的江蘺屬和龍須菜屬5個物種的23個群體中，龍須菜8個群體24株個體的平均遺傳距離為0.000，存在2個變異位點；芋根江蘺2個群體6株個體的平均遺傳距離為0.003，存在12個變異位點；脆江蘺2個群體6株個體的平均遺傳距離為0.000，存在1個變異位點；細基江蘺繁枝變種6個群體17株個體的平均遺傳距離為0.004，存在16個變異位點；上述物種不存在群體區(qū)分位點。真江蘺5個群體13株個體的平均遺傳距離為0.002，13個變異位點，且中國、俄羅斯和美國三地的種群間存在9個穩(wěn)定有效的信息位點，可區(qū)分三地的群體(見圖2)，但在中國兩野生真江蘺群體間存在6個變異位點，均為個體的隨機變異，并無穩(wěn)定有效的信息位點。

單獨對江蘺科海藻的5.8S序列進行分析，比對后序列長度為162 bp(including gaps)，存在36個變異位點，其中包括了14個信息位點，序列比對結果見圖1。江蘺屬與龍須菜屬物種間的遺傳距離在0.046～0.084之間，存在7～11個變異位點，其中4個位點可進行屬的鑒別。江蘺屬與Hydropuntia物種間的遺傳距離在0.006～0.026之間，存在1～4個變異位點，其中有1個位點可進行屬的鑒別。江蘺屬與蘺生藻屬物種間的遺傳距離在0.099～0.116之間，存在13～17個變異位點，其中12個位點可進行屬的鑒別。龍須菜屬與Hydropuntia物種間的遺傳距離在0.052～0.080之間，存在8～12個變異位點，其中5個位點可進行屬的鑒別。龍須菜屬與蘺生藻屬物種間的遺傳距離為0.073～0.101，存在11～15變異位點，其中7個位點可進行屬的鑒別。Hydropuntia與蘺生藻屬物種間的遺傳距離為0.123，存在18個變異位點，均可進行屬的鑒別。在江蘺屬中，除細基江蘺G.tenuistipitata、智利江蘺G.chilensis和G.pacifica外，其他物種的5.8S序列完全一致；細基江蘺G.tenuistipitata和智利江蘺G.chilensis除堿基缺失外，兩者與其他江蘺屬物種都存在一個位點的變異；G.pacifica與細基江蘺G.tenuistipitata、智利江蘺G.chilensis的遺傳距離均為0.029，與其他江蘺屬物種間的遺傳距離均為0.019，存在3個變異位點。龍須菜屬的龍須菜種內(nèi)遺傳距離為0.000，與Gp.tenuifrons物種間的遺傳距離為0.060，存在10個變異位點。Hydropuntia中H.caudata和H.crassissima兩物種5.8S序列完全一致。所有江蘺科物種的5.8S序列種內(nèi)遺傳距離都為0.000。

圖2 真江蘺不同地理群體間 ITS序列穩(wěn)定有效信息位點

表 3 江蘺科海藻的種間遺傳距離1)

圖3 江蘺科海藻ITS 序列系統(tǒng)進化樹(MP)

2.3 ITS系統(tǒng)樹構建

根據(jù)江蘺科物種ITS序列用NJ、MP和ML法構建系統(tǒng)樹，3種方法聚類結果一致，僅列出MP法構建的系統(tǒng)樹(見圖3)。比對后總1772位點矩陣，302個穩(wěn)定位點，91個變異位點但無信息的位點，1 379個信息位點，啟發(fā)式搜尋后最終獲得1個最優(yōu)簡約樹，步長為5 435，一致性指數(shù)(CI)和嚴格性指數(shù)(RI)分別是0.586和0.765。從系統(tǒng)樹結構中可以看出，20種江蘺科海藻可基本分為2大分支，包括龍須菜屬/蘺生藻屬分支，江蘺屬/Hydropuntia分支。其中龍須菜屬和蘺生藻屬處在系統(tǒng)樹的最基部，說明其分化時間可能早于江蘺屬/Hydropuntia。江蘺屬/Hydropuntia形成了3個小的分支，分別是細基江蘺繁枝變種G.tenuistipitatavar.liui分支、真江蘺G.vermiculophylla分支、脆江蘺G.chouae與芋根江蘺G.blodgettii分支；青島與威海的野生真江蘺關系最近，其次是俄羅斯和美國的養(yǎng)殖真江蘺，支持率分別為100、84和100。

3 討 論

江蘺科4個屬20個物種ITS長度差異較大，遺傳距離和系統(tǒng)聚類分析結果顯示，不同種、屬之間存在較為廣泛的變異。Yamamoto等[24]根據(jù)精子囊窠的發(fā)生位置將江蘺屬分為江蘺屬、Hydropuntia和龍須菜屬。但在本研究中用ITS序列構建系統(tǒng)樹，結果顯示Hydropuntia物種聚類到江蘺屬內(nèi)，并未形成單獨的分支，不存在明顯的屬間遺傳分化，但與龍須菜屬/蘺生藻屬分別聚在兩大分支上，存在明顯的屬間遺傳分化。這與之前報道的SSU rDNA、Rubisco spacer和rbcL序列系統(tǒng)聚類的結果是一致的[10,12,15]。在江蘺屬系統(tǒng)分類中，江蘺屬和Hydropuntia海藻精子囊窠包括了“V”型、“T”型和“P型”3種類型，而龍須菜屬精子囊窠則屬于“C型”[25]，在系統(tǒng)樹中可以將其分為兩組；但江蘺屬和Hydropuntia海藻并未按其精子囊窠排列方式的類型而形成單獨的分支，也沒有形成與地域分布相關的分支，這可能與這兩個屬存在著并系起源關系有關。籬生藻屬寄生于江蘺屬、Hydropuntia和龍須菜屬海藻，其藻體內(nèi)部構造和生殖結構同于江蘺屬、Hydropuntia和龍須菜屬[26]；蘺生藻屬海藻是從最初的宿主藻體進化而來[27]，在寄生過程中可從宿主獲取葉綠體，而保留自身的核基因組和線粒體基因組[28]，Bellorin等[10]認為籬生藻屬與龍須菜屬海藻屬于并系起源，至少有一個籬生藻屬物種是由龍須菜屬演化而來；本研究也顯示了同樣的結果。但是蘺生藻屬海藻寄生過程中是否會與宿主發(fā)生遺傳物質(zhì)的水平轉(zhuǎn)移，以及在不同寄主中是否多次發(fā)生遺傳物質(zhì)的水平轉(zhuǎn)移還有待證實。

ITS序列無論是在序列長度還是變異程度上都能很好地區(qū)分和鑒定江蘺科物種。細基江蘺和細基江蘺繁枝變種的形態(tài)學主要差異是前者分枝1～2次，后者具有更多纖細的分枝；盡管細基江蘺和細基江蘺繁枝變種的ITS序列遺傳距離低于江蘺科全部海藻的種間差異，屬于種內(nèi)差異水平，但其存在著25個變異位點，包括了14個種間區(qū)分位點，同時細基江蘺5.8S序列較江蘺屬海藻缺失20個堿基，顯示出獨特的序列結構，這可能意味著細基江蘺與細基江蘺繁枝變種之間的分類地位還需要進一步的研究確認。

江蘺科海藻5.8S序列長度相對ITS1和ITS2保守，且種內(nèi)和種間變異很小，存在著特定的穩(wěn)定屬間區(qū)分位點，且對于具有并系關系的屬(江蘺屬/Hydropuntia和龍須菜屬/蘺生藻屬)也具有穩(wěn)定的區(qū)分位點，因此利用這些位點可以進行江蘺科屬水平上的分類鑒定。同樣已報道的江蘺科18S rDNA序列，也存在這特定的屬間區(qū)分位點，能夠很好地區(qū)分屬[12]。

本研究顯示，龍須菜、脆江蘺和真江蘺(美國和俄羅斯)的養(yǎng)殖群體的群體間和群體內(nèi)變異相比野生群體遺傳變異較小，江蘺科海藻養(yǎng)殖主要通過無性繁殖進行，不發(fā)生有性生殖過程的雜交以及無性繁殖的遺傳重組，這種養(yǎng)殖群體變異水平降低的情況可能是由于養(yǎng)殖篩選的影響；但在細基江蘺繁殖變種的養(yǎng)殖群體存在相對較高的遺傳變異，這可能是由于其自然分布和養(yǎng)殖主要集中在亞熱帶和熱帶海域，生長速率和養(yǎng)殖繼代頻率高，導致其群體ITS序列變異幅度高于其他江蘺種群。在來自中國、俄羅斯和美國三地的真江蘺群體中，存在著9個與地理分布相關的信息位點，可以進行群體的有效區(qū)分。這與在真江蘺、提克江蘺G.tikvahiae、繩江蘺Gp.chorda、張氏江蘺G.changii的cox1和rbcL基因序列存在的與地理位置相關的單倍型是一致的[29-32]。但在青島和威海的真江蘺野生群體間并不存在種群間的穩(wěn)定區(qū)分位點，因此，信息位點在地理群體識別的方面應用需要考慮到群體數(shù)量以及地理距離的因素。

4 前景展望

隨著分子生物學研究的不斷深入發(fā)展，核酸數(shù)據(jù)的不斷積累，利用單個或多個DNA序列并結合物種形態(tài)學研究物種分類與系統(tǒng)進化，逐漸成為現(xiàn)代生物學研究的有力工具。目前，DNA序列分析在藻類分類鑒定中得到了廣泛的應用，對闡明系統(tǒng)進化關系提供了重要的證據(jù)。但從分子系統(tǒng)學研究手段本身而言，也存在很多需要進一步研究和探討的問題。不同類群同一DNA序列的進化速率有所差異，同一類群中不同DNA序列的進化速率也不相同，另外由于藻類早期演化中存在著線粒體和葉綠體內(nèi)共生現(xiàn)象，其在平行演化中又存在著并系起源和直系起源現(xiàn)象，這為研究藻類系統(tǒng)發(fā)育與分化增添了較大的難度。從多個層次以及多個基因位點上系統(tǒng)地研究藻類形態(tài)結構進化、生態(tài)適應以及基因進化的內(nèi)在關系則顯得更為重要和迫切。

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