王 羽

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微生態(tài)制劑(EM-1號原液)對金鯽魚淀粉酶的影響

王 羽

福州教育學(xué)院

利用不同劑量的微生態(tài)制劑( EM-1號原液)添加在飼料中飼養(yǎng)金鯽魚5周,測定金鯽魚外部生長指標(biāo)以及與魚生長有密切相關(guān)的淀粉酶活性、活力指標(biāo)。結(jié)果顯示:試驗組的淀粉酶活性、活力等生長相關(guān)指標(biāo)均優(yōu)于對照組，且隨著EM-1號原液添加劑量的增加而提高，表明EM-1號原液能改善金鯽魚生長指標(biāo)，提高機(jī)體的新陳代謝，加快生長速度。

微生態(tài)制劑（EM-1號原液） 金鯽魚 生長 淀粉酶指標(biāo)

微生態(tài)制劑是綠色飼料添加劑[1]。目前，復(fù)合微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用已越來越受到廣大養(yǎng)殖者的關(guān)注，它是近十年發(fā)展起來的新型微生物飼料添加劑，根據(jù)微生態(tài)理論研究研制的微生態(tài)制劑體現(xiàn)出許多優(yōu)越性：可以克服濫用抗生素引起的魚類內(nèi)源性感染或二重感染，并且在取代抗生素方面體現(xiàn)出特有的優(yōu)勢，它有抗生素和酶的功能，可提高飼料轉(zhuǎn)化率，預(yù)防疾病，促進(jìn)生長；它具有顯著增強其免疫功能、抗病、促生長、提高飼料利用率等特點[2]。

EM-1號原液是一種比較常見的微生態(tài)制劑，目前在整個水產(chǎn)養(yǎng)殖中大多是直接作用于水體，能抑制病原微生物和有害物質(zhì)調(diào)節(jié)生態(tài)環(huán)境，提高水中的溶氧量，促進(jìn)養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)中的正常菌群和有益藻類活化生長，保持養(yǎng)殖水體的生態(tài)平衡[3]。若拌入餌料投喂，可直接增強魚類的吸收功能和防病抗病能力，促進(jìn)其健壯生長。但是EM-1號原液在魚類上發(fā)揮抗病、促生長、提高飼料利用率機(jī)理的研究較少，本試驗旨在通過對飼喂不同濃度EM-1號原液的金鯽魚，了解添加EM-1號原液對其生長和淀粉酶活性、活力指標(biāo)的影響，為合理配制飼料，改善魚體質(zhì)，實現(xiàn)魚類的健康養(yǎng)殖提供一定的理論依據(jù)。

1 實驗材料及方法

1.1 實驗用魚

金鯽魚（）購自于泉州東街市場，健康，在實驗室內(nèi)暫養(yǎng)2天后進(jìn)行試驗。

1.2 實驗用微生態(tài)制劑

微生態(tài)制劑選用EM-1號原液。EM是英語Effective和Microorganisms的縮寫，不含任何化學(xué)有害物質(zhì)，無毒副作用[4]，無殘留和二次污染，不產(chǎn)生抗藥性。

原料組成：光合菌群、乳酸菌群、酵母菌群、發(fā)酵絲狀菌群、革蘭氏陽性放線菌及糖蜜等。

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：有效活菌數(shù)不少于108(億)/ mL、pH值小于3.5，棕色半透明液體，由5科10屬80多種有益微生物復(fù)合培養(yǎng)而成。

1.3 實驗試劑及藥品

考馬斯亮藍(lán)G-250、KH2PO4、NaHPO4·2H2O、雙蒸水、可溶性淀粉、95%乙醇、HCl、NaCl、3,5—二硝基水楊酸、NaOH、酒石酸銅鈉、結(jié)晶小牛血清蛋白(BAS)、麥芽糖，磷酸緩沖液pH7.0（0.067mol/L）、淀粉溶液1%等。

3,5—二硝基水楊酸試劑：稱取3,5—二硝基水楊酸2.25g，溶于100mL 12mol/L的NaOH溶液中，再加入少量的蒸餾水，加入150g酒石酸鈉，待溶解后用蒸餾水定溶至500mL。蓋緊瓶塞，勿使CO2進(jìn)入，若溶液渾濁，可過濾后使用。

考馬斯亮藍(lán)染液的配制：先稱取0.125g考馬斯亮藍(lán)G-250溶于100mL95％乙醇中。（燒杯定容）然后量取15mL 37％HCl, 稱取5.06g NaCl于雙蒸水中。將上面兩種溶液混合定容至1000mL，過濾后取濾液(需要較長時間，棕色瓶裝考馬斯亮藍(lán)染液)。

牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白液的配制：用電子天平準(zhǔn)確稱取牛血清白蛋白0.060g，溶于4mL雙蒸水中配置成15mg/mL牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白液，按照一定比例以15mg/mL牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白液分別稀釋成12mg/mL、10mg/mL、8mg/mL、6mg/mL、5mg/L、3mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白液。

1.4 實驗儀器

分光光度計（7220型）、SiGmA高速冷凍離心機(jī)、電子天平、冰箱、烘箱、電爐、恒溫水浴鍋、移液槍（0.5～10μL）、玻璃勻漿器、50mL棕色定容器、100mL棕色容量瓶、必備的化學(xué)器皿等。

1.5 實驗方法

1.5.1 微生態(tài)制劑的添加劑量和方式

試驗魚每日按體重的3%～5%比例投餌,于8: 00和17: 00分2次投喂。對照組投基礎(chǔ)餌料，試驗組投食噴有微生態(tài)制劑的餌料分為C0（對照組）、C1、C2、C3。實驗組在基礎(chǔ)餌料中分別加入不同濃度的微生態(tài)制劑。

表1 不同實驗組飼料中EM-1號原液的添加量

1.5.2 粗酶液制備

取出組織樣品，剔除附著物，稱重，每克組織中加入4mL重蒸餾水，于冰浴中，進(jìn)行勻漿，將勻漿液裝入10mL的塑料離心管中，用冷凍離心機(jī)于0℃，11000r/min離心40min，上清液即為粗酶提取液，暫存于-20℃冰箱中，24小時內(nèi)測定蛋白含量和淀粉酶活性。

1.5.3 生長性能測定和餌料系數(shù)的計算

餌料系數(shù)(F/G)=投餌量/魚體增重量，即F/(W2-W1)。

相對增重率(RGRW)=( W2-Wl)/W1×100%。

1.5.4 pH值變化測定

pH值對魚類生理活動的影響是多方面的[5]。pH值也是水質(zhì)的重要指標(biāo)，對魚類等水產(chǎn)動物的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)具有重要作用，每隔5天測定水體pH的變化情況。

1.5.5酶蛋白質(zhì)含量的測定

粗酶中蛋白含量用考馬斯亮藍(lán)法測定[6]。考馬斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，在稀酸溶液中，當(dāng)它與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，前者最大光吸收?65nm，后者在595nm。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)(1～100μg)，蛋白質(zhì)與色素結(jié)合物在595nm波長下的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合，在2min左右的時間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速，其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。

1.5.5.1蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

在比色杯中用移液槍加入2mL的考馬斯亮藍(lán)染液和5μL的雙蒸水作為空白液，在波長595nm處比色；同樣在2mL的考馬斯亮藍(lán)染液中加入上述幾個濃度梯度小牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白液測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)液濃度(μg／ml)作為橫坐標(biāo)作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 小牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.5.5.2粗酶液蛋白質(zhì)含量的測定

用移液槍取2mL的考馬斯亮藍(lán)染液直接加入比色杯中，再加入5μL的待測酶液，攪拌均勻，于波長595nm處比色，讀取吸光度，由樣品液的吸光度查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出含量。

表2 粗酶液蛋白質(zhì)含量的測定

1.5.6麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

參考任永波等方法，因為淀粉酶水解產(chǎn)物麥芽糖及其還原糖能與3,5-二硝基水楊酸試劑反應(yīng)，使其還原成紅色3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定的范圍內(nèi)，其顏色深淺與淀粉酶水解產(chǎn)物的濃度成正比，所以酶活力可以用麥芽糖（或葡萄糖）濃度表示，用比色法測定淀粉酶生成還原糖的量，以單位時間內(nèi)生成的麥芽糖的量表示酶活力。具體的步驟如下，用7支干凈的有刻度的試管并編號，按表3加入各試劑。

表3 麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法

搖勻后，置沸水中煮沸5min，取出后冷卻，加蒸餾水定溶至10mL。以1號管空白調(diào)零，在540nm處比色測定。以麥芽含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

1.5.7 淀粉酶活力測定

參照沈文英等方法，在具有刻度的試管中加入用pH7.0，0.067mol/L磷酸緩沖液配制1%的淀粉溶液0.5mL，酶液0.5mL，搖勻；置于25℃水浴中，保溫3min；再加入3,5-二硝基水楊酸指示劑溶液2.0mL，置于沸水中5min，取出流水冷卻，定溶至10mL，可見光分光光度計540nm處比色，記錄吸光值，查麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得知麥芽糖含量。在25℃條件下，每分鐘催化淀粉生成1.0μg麥芽糖作為一個活力單位。

計算公式：

淀粉酶活力（U）=麥芽糖微克數(shù)×粗酶液稀釋倍數(shù)/反應(yīng)時間

淀粉酶比活力（U/mg.Pr）=淀粉酶總活力/蛋白含量

淀粉酶比活力定義為每克新鮮組織的酶活力單位（U/g），脂肪酶比活力為每升酶液的酶活力單位。

2 實驗結(jié)果及分析

2.1 生長性能測定和餌料系數(shù)的計算

表4 試驗前后魚體重量變化

表5 各個實驗組測定指標(biāo)

2.2 pH值變化測定

pH值對魚類生理活動的影響是多方面的[5]。pH值也是水質(zhì)的重要指標(biāo)，對魚類等水產(chǎn)動物的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)具有重要作用。

圖3 pH值變化折線圖

EM-1號原液復(fù)合微生物制劑對養(yǎng)殖水pH值的影響水體中的pH值變化折線圖顯示，4組pH值的變化情況相差不大，但是對照組相比之下波動較大。試驗池水質(zhì)的pH值平穩(wěn)，始終保持在7.25～7.56范圍內(nèi)；而對照池水質(zhì)的pH相比波動大，在7.26～7.66范圍波動。pH變化主要是水體中藻類的光合作用所致，pH值變動越平穩(wěn)，則說明藻菌的動態(tài)生態(tài)效果越好，可防止水環(huán)境產(chǎn)生陡變，避免養(yǎng)殖生物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，同時有利于水中污染物高效率地降解、轉(zhuǎn)化和有益微生物較好發(fā)揮作用[7]。

同時，有研究表明，EM-1號原液不僅對水體有作用，對飼料也具有明顯的酸化作用[8]，將飼料酸化后可以改善動物的生產(chǎn)性能[9]。飼料酸化后，可使胃內(nèi)pH值下降。這對于消化系統(tǒng)尚未發(fā)育的幼齡動物來說，作用更明顯[10]。

當(dāng)然，微生態(tài)制劑對養(yǎng)殖水體的生物修復(fù)也存在自身的局限性。例如，微生態(tài)制劑中特定的有益菌株只能降解特定類型的化學(xué)物質(zhì)，狀態(tài)稍有變化的化合物可能不會被同一微生物酶破壞；微生態(tài)制劑不能降解所有進(jìn)入養(yǎng)殖水體的有毒有害物質(zhì)，這些物質(zhì)的難生物降解性、不溶性以及與土壤腐殖質(zhì)或泥土結(jié)合在一起常常使生物修復(fù)不能進(jìn)行等等。

2.3 淀粉酶活性測定

淀粉酶活性測定方法參照張龍翔等(1981)、蔣傳葵(1982)，以1.0%可溶性淀粉作底物，用分光光度計于540nnl測出吸光值(A)。用1.0mL標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液作同樣的操作(標(biāo)準(zhǔn)空白以等體積蒸餾水替代標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液)。淀粉酶活性單位：1g新鮮組織在25℃、pH8.0條件下，1min內(nèi)使可溶性淀粉分解產(chǎn)生麥芽糖的微克數(shù)表示(μg'maltose/g*min)。

表6 淀粉酶吸光值

取值：各個組別取最高值進(jìn)行計算，C0為1.181, C1為1.482, C2為1.701, C3為1.715。

查上表得知各組麥芽糖含量(mg)分別是：C03.583，C14.625，C25.383，C35.431。

C0:淀粉酶活力（U）=3.583×20/3=23.887

淀粉酶比活力（U/mg.Pr）=23.887/6.932=3.446

C1:淀粉酶活力（U）=4.625×20/3=30.833

淀粉酶比活力（U/mg.Pr）=30.833/7.234=4.262

C2:淀粉酶活力（U）=5.383×20/3=35.887

淀粉酶比活力（U/mg.Pr）=35.887/7.643=4.695

C3:淀粉酶活力（U）=5.431×20/3=36.207

淀粉酶比活力（U/mg.Pr）=36.207/7=4.982

試驗結(jié)果表明，投喂EM-1號原液微生物制劑后，試驗組肝胰臟淀粉酶活性均比對照組顯著提高。推測EM-1號原液微生物制劑能為金鯽魚提供外源脂肪酶，促進(jìn)飼料中脂肪成分的消化，從而提高了飼料的消化利用率。劉江軍等[11]、黃永春等[12]利用EM在養(yǎng)殖魚類試驗中發(fā)現(xiàn)，將EM添試驗組的成活率均高于對照組，試驗各組增重率均優(yōu)于對照組；蒲紅宇等[13-14]的研究結(jié)果表明，微生物制劑對魚類淀粉酶活性有明顯提高，從而促進(jìn)消化道分解酶活性提高，促進(jìn)了魚類對飼料的消化吸收和魚類生長。由此我們可推測肝胰臟是淀粉酶生成的主要器官，其分泌機(jī)能的強弱直接影響魚類對食物中淀粉的消化能力。淀粉酶活性增強也是促進(jìn)金鯽魚生長的重要因素。

EM—1號原液不僅具有提高餌料生物的品質(zhì)和對餌料的攝食量以及消化吸收的能力，以促進(jìn)生長，而且能改善水質(zhì)環(huán)境。本試驗組魚體的淀粉酶活性、活力和生長速度明顯高于對照組，也反映了EM—1號原液在促進(jìn)魚體生長、改善增重和增加免疫力[15]效果方面所起到的積極作用。

3 前景

微生態(tài)制劑可以提高魚類淀粉酶活性已為眾多實驗所證實，但對其機(jī)理研究較少，目前有學(xué)者認(rèn)為：一些益生菌能產(chǎn)生多種酶類參與動物消化道的“酶池”，并提高動物消化酶活性，促進(jìn)動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。Sogarrd[16]報道，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌具有較強的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，同時還具有降解植物飼料中非淀粉多糖的酶?？傊?，微生態(tài)制劑提高魚類淀粉酶活性的機(jī)理還知之甚少，有待于進(jìn)一步研究，隨著研究的深入，微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的運用將會有更加輝煌的明天。

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