杜冬冬，王 濤，常維山

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安 271018)

藥物濫用導(dǎo)致大腸桿菌等細(xì)菌的耐藥性是影響畜牧業(yè)健康發(fā)展的主要原因，如何減少細(xì)菌耐藥性，已經(jīng)成為人們越來越關(guān)心的話題。著眼于目前養(yǎng)殖行業(yè)的實(shí)際情況，新獸藥的研發(fā)和合理用藥是解決目前問題的關(guān)鍵，但是獸藥研發(fā)周期長，合理用藥是目前最適合的方法。兩種或兩種以上抗生素藥物配伍時(shí)，可發(fā)生兩種截然不同的效果。作用相加或協(xié)同，療效增強(qiáng)對(duì)治療大有裨益，臨床宜多用;作用拮抗，療效降低或毒性增強(qiáng)，對(duì)治療頗為有害，臨床禁用［1］。試驗(yàn)選取的亞胺培南、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟鈉均屬于β－內(nèi)酰胺類，其作用機(jī)理為抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，是繁殖期殺菌劑［2］;阿米卡星，又名丁胺卡那霉素，是半合成的氨基糖苷類抗生素，其作用機(jī)理是抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成［2］;痢菌凈，又名乙酰甲喹，其作用機(jī)制是抑制細(xì)菌的DNA合成［2］。亞胺培南抗菌譜最廣，抗菌作用最強(qiáng)，是對(duì)β－內(nèi)酰胺酶高度穩(wěn)定的一種β－內(nèi)酰胺類抗生素［3］，本試驗(yàn)旨在研究亞胺培南與頭孢曲松鈉、亞胺培南與頭孢噻肟鈉聯(lián)用后對(duì)大腸桿菌的抗菌活性及聯(lián)合效果，從而為臨床用藥提供指導(dǎo)［4－5］。痢菌凈為臨床常用藥，但其治療劑量接近中毒劑量，臨床應(yīng)用易中毒。研究丁胺卡那與痢菌凈聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大腸桿菌的抑菌效果，從而確定兩種藥物聯(lián)用是否可以降低痢菌凈的用量。通過聯(lián)合用藥以減少細(xì)菌耐藥性和藥物用量，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 抗菌藥物 亞胺培南(含量 50%，批號(hào)10007)，韓國中外制藥株式會(huì)社;頭孢曲松鈉(含量98%，批號(hào)100723)，上海新亞藥業(yè)有限公司;痢菌凈(含量98.5%，批號(hào)060509)，成都華康動(dòng)物藥業(yè)有限公司;頭孢噻肟鈉(含量 97.5%，批號(hào)100201)，上海新先鋒藥業(yè)有限公司;丁胺卡那(含量96%，批號(hào)100716)，上海新亞藥業(yè)有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)菌株 大腸桿菌(ATCC25922)，南京便診生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 Muller－Hinton(MH)肉湯和Muller－Hinton(MH)瓊脂培養(yǎng)基，美國Difco公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 稀釋藥物 無菌精確稱取亞胺培南、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟鈉、丁胺卡那、痢菌凈，用無菌蒸餾水溶解并稀釋成2048 μg/mL的溶液，于－20℃保存［6］。

1.2.2 菌懸液的制備 從過夜培養(yǎng)的瓊脂培養(yǎng)基平板上挑取3個(gè)菌落，接種于MH肉湯中增菌6 h。以平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)后，用MH肉湯稀釋1.5 ×105CFU/mL［7］。

1.2.3 最小抑菌濃度的測定(MIC)參照微量肉湯稀釋法測定各抗生素單用的最小抑菌濃度(MIC)。將亞胺培南、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟鈉、丁胺卡那、痢菌凈等5種抗菌藥物以滅菌MH肉湯倍比稀釋成 23個(gè)濃度，分別為 2048、1024……0.0005 μg/mL，分別取 100 μL 依次加入 96 孔板，再將 1.5×105CFU/mL菌液 100 μL加入孔中，37℃過夜培養(yǎng)，觀察結(jié)果，以無菌生長的最低濃度為該藥單用最小抑菌濃度 MIC［8－10］。

1.2.4 亞胺培南與頭孢曲松鈉藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大腸桿菌ATCC25922的FIC指數(shù)測定 將亞胺培南和頭孢曲松鈉分別用滅菌MH肉湯倍比稀釋，按棋盤法設(shè)計(jì)兩兩組合加入一次性96孔板至第11列、第7行(第12列和第8行為空白對(duì)照)。根據(jù)最小抑菌濃度的測定，使最高濃度為單藥MIC的2倍。抗菌藥物按濃度梯度各取50 μL，再加入1.5×105CFU/mL菌液100 μL，37℃過夜培養(yǎng)，觀察結(jié)果，選擇兩藥聯(lián)合應(yīng)用FIC指數(shù)最小時(shí)作為兩種藥物的最佳組合，并且以該FIC指數(shù)判定兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的效果。亞胺培南與頭孢噻肟鈉、丁胺卡那與痢菌凈FIC指數(shù)測定試驗(yàn)方法同上。

1.2.5 判斷標(biāo)準(zhǔn) FIC指數(shù) =(MIC甲藥聯(lián)用/MIC甲藥單用)+(MIC乙藥聯(lián)用/MIC乙藥單用)。FIC指數(shù)≤0.5，為協(xié)同作用;FIC指數(shù)在0.5～1范圍，為相加作用;FIC指數(shù)在1～2范圍，為無關(guān)作用;FIC指數(shù)＞2，為拮抗作用。

2 結(jié)果及分析

2.1 亞胺培南與頭孢曲松鈉MIC試驗(yàn)結(jié)果 亞胺培南、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟鈉、丁胺卡那、痢菌凈等5種抗菌藥物對(duì)大腸桿菌ATCC25922體外最小抑菌濃度如表1所示，可以看到亞胺培南對(duì)大腸桿菌ATCC25922最小抑菌濃度最小，這說明了亞胺培南具有很強(qiáng)的抗菌能力。本次試驗(yàn)著重研究了亞胺培南與頭孢曲松鈉、亞胺培南與頭孢噻肟鈉聯(lián)合抗菌效果。

2.2 亞胺培南與頭孢曲松鈉聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大腸桿菌ATCC25922試驗(yàn)結(jié)果 如表2所示，亞胺培南與頭孢曲松鈉聯(lián)合應(yīng)用FIC指數(shù)小于0.5，兩藥聯(lián)用呈現(xiàn)協(xié)同效果。亞胺培南與頭孢曲松鈉聯(lián)合應(yīng)用使兩藥分別增效8倍與16倍。

2.3 亞胺培南與頭孢噻肟鈉聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大腸桿菌ATCC25922試驗(yàn)結(jié)果 亞胺培南與頭孢噻肟鈉聯(lián)合應(yīng)用FIC值數(shù)為0.5，說明兩藥呈現(xiàn)協(xié)同作用(表3所示)。頭孢噻肟鈉為繁殖期抑菌劑，與亞胺培南聯(lián)用其效果增強(qiáng)4倍，大大減少了藥物用量，提高了藥物效果。

表3 亞胺培南與頭孢噻肟鈉聯(lián)合應(yīng)用FIC值

2.4 丁胺卡那與痢菌凈聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大腸桿菌ATCC25922試驗(yàn)結(jié)果 痢菌凈是價(jià)格便宜、抗菌效果好的藥物，然而其毒性較強(qiáng)，臨床應(yīng)用治療量與藥物中毒量非常接近。痢菌凈應(yīng)用中毒是在養(yǎng)殖中經(jīng)常出現(xiàn)的問題，與丁胺卡那聯(lián)合應(yīng)用可以減少用藥量，提高藥物效果。如表4所示，丁胺卡那與痢菌凈聯(lián)合應(yīng)用FIC值小于0.5，呈現(xiàn)協(xié)同作用，可以使痢菌凈在原有治療效果上大大減少用藥量。

表4 丁胺卡那與痢菌凈聯(lián)合應(yīng)用FIC值

3 討論

近年來大腸桿菌耐藥性日趨嚴(yán)重，藥物預(yù)防和治療用量逐年增加［11］。為減少細(xì)菌耐藥性和降低藥物用量，聯(lián)合用藥是目前有效的解決方法。應(yīng)用棋盤微量稀釋法選取亞胺培南與頭孢曲松鈉、亞胺培南與頭孢噻肟鈉、丁胺卡那與痢菌凈聯(lián)合應(yīng)用，研究其對(duì)大腸桿菌的抗菌效果。試驗(yàn)結(jié)果顯示亞胺培南與頭孢曲松鈉、亞胺培南與頭孢噻肟鈉、丁胺卡那與痢菌凈聯(lián)合應(yīng)用均呈現(xiàn)協(xié)同作用。亞胺培南單用時(shí)其MIC為0.125 μg/mL，與頭孢曲松鈉聯(lián)合應(yīng)用時(shí)MIC為0.0156 μg/mL，其 MIC值降低至原用藥量的1/8;亞胺培南與頭孢噻肟鈉聯(lián)合應(yīng)用時(shí)亞胺培南MIC值為0.0313 μg/mL，其MIC值降低至原用藥量的1/4，同時(shí)亞胺培南與頭孢曲松鈉聯(lián)合應(yīng)用使頭孢曲松鈉增效16倍，而亞胺培南與頭孢噻肟鈉聯(lián)合應(yīng)用使頭孢噻肟鈉增效4倍。這說明相同類型的藥物與亞胺培南聯(lián)合應(yīng)用增效倍數(shù)不同，是由于這兩種藥物與細(xì)菌的相互作用機(jī)制不同所導(dǎo)致。

痢菌凈單用時(shí)MIC值為16 μg/mL，與丁胺卡那聯(lián)合應(yīng)用時(shí)MIC值為1 μg/mL，其MIC值降低至原用藥量的1/16。痢菌凈在臨床用藥時(shí)可以通過與丁胺卡那聯(lián)合應(yīng)用降低其藥物用量，從而使其用量可以遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其中毒劑量。

總之，這幾種藥物聯(lián)合應(yīng)用不但可以減少用藥量，并且可以降低細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，從而降低用藥成本、減少藥物殘留。

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