傅彩霞，鄭瑞峰，郭 峰，靳興軍，吳惠明，李 佳，陳立本，王玉田

（北京市獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)診斷所，北京 100101）

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由黃病毒科瘟病毒屬的豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一種以高熱、出血和高病死率為特征的高度接觸性傳染病，是嚴(yán)重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染?。?］。在我國(guó)，雖然豬瘟兔化弱毒疫苗的使用較好地控制了CSF的大規(guī)模流行，但目前在我國(guó)的大部分地區(qū)CSF仍有散發(fā)，并且其流行與發(fā)病特點(diǎn)發(fā)生了很大的變化，以非典型、溫和型、母豬繁殖障礙型以及新生仔豬發(fā)病、死亡為主［2］，與其他病毒混合感染日趨嚴(yán)重。許多地區(qū)都已相應(yīng)開(kāi)展了CSFV分子流行病學(xué)研究，這些研究對(duì)所在地區(qū)CSF的防控發(fā)揮了一定的作用。而目前，北京地區(qū)缺乏近年CSFV感染的詳細(xì)分子流行病學(xué)研究資料，因此，為了解目前北京地區(qū)CSFV流行毒株的遺傳變異情況以及其與CSFV疫苗株之間的差異，進(jìn)一步完善、加強(qiáng)CSF的防控，有必要對(duì)CSFV流行毒株進(jìn)行系統(tǒng)的分子流行病學(xué)研究分析。CSFV的E2糖蛋白是CSFV最主要的保護(hù)性抗原蛋白，存在于感染細(xì)胞或病毒粒子表面，相對(duì)于其他結(jié)構(gòu)蛋白保守性最低，最易發(fā)生變異。編碼CSFV E2蛋白的基因參與病毒對(duì)細(xì)胞的感染過(guò)程，與病毒毒力有關(guān)，攜帶有能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫的抗原決定簇［3－4］，許多學(xué)者認(rèn)為CSFV的E2抗原變異有可能是導(dǎo)致該病毒逃脫或抵御免疫保護(hù)的主要原因。本研究對(duì)2010年從北京部分地區(qū)分離的7株CSFV流行毒株的E2基因主要抗原編碼區(qū)序列進(jìn)行了測(cè)定與分析，旨在通過(guò)分子流行病學(xué)研究的方法，為了解北京地區(qū)CSFV流行毒株的遺傳變異規(guī)律及制定更為科學(xué)合理的防控措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 7株CSFV流行野毒，分別于2010年采自北京市通州區(qū)、平谷區(qū)、大興區(qū)、房山區(qū)的部分豬場(chǎng)，均通過(guò)PK－15細(xì)胞傳代3代，獲得細(xì)胞毒，經(jīng)CSFV RT－PCR（北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司試劑）檢測(cè)為陽(yáng)性，分別命名為BJTZ1.10、BJTZ2.10、BJTZ3.10、BJTZ4.10、BJPG1.10、BJDX1.10和BJFS1.10。

1.1.2 主要試劑 核酸柱式提取試劑盒為北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司產(chǎn)品；pGEM－T載體、DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒提?。兓噭┖?、BstZⅠ限制性?xún)?nèi)切酶均為Promega公司產(chǎn)品；其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 引用國(guó)際通用且推薦用于CSFV診斷以及序列比較的E2部分基因擴(kuò)增引物［5］，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。外套引物 擴(kuò) 增 671bp：P1 5′－AGRCCAGACTGGTGGCCNTAYGA－3′，P2 5′－TTYACCACTTCTGTTCTCA－3′；內(nèi) 套 引 物 擴(kuò) 增 272bp：P3 5′－TCRWCAACCAAYGAGATAGGG－3′， P4 5′－CACAGYCCRAAYCCRAAGTCATC－3′。

1.2 方法

1.2.1 病毒核酸的提取 具體操作參照核酸柱式提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，同時(shí)以ddH2O和CSFV疫苗毒為陰、陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄（cDNA的合成） 將提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系（20μL）包含DEPC H2O 3.1μL、5×buffer 4μL、10mmol／L dNTP 0.4μL、RNase抑制劑0.5μL、AMV反轉(zhuǎn)錄酶1μL、隨機(jī)引物1μL、RNA模板10μL，將上述溶液混勻，瞬時(shí)離心。42℃作用90min，95℃作用5min。

1.2.3 PCR反應(yīng) 取2μL RT產(chǎn)物，建立50μL外套PCR體系；同樣條件下，以2μL外套產(chǎn)物為模板，建立50μL內(nèi)套PCR體系。反應(yīng)體系為：ddH2O 32.5μL，5×buffer 10 μL，10mmol／L dNTP 1μL，20μmol／L各種引物各1μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μL，TaqDNA聚合酶（5U／μL）0.5μL，將上述溶液瞬時(shí)離心，混勻。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3min；95℃變性45s，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。

1.2.4 DNA片段的回收與純化 在12g／L的瓊脂糖凝膠上電泳PCR產(chǎn)物，切下目的條帶，用DNA純化／回收試劑盒對(duì)DNA片段進(jìn)行回收純化，回收純化產(chǎn)物溶解于50μL無(wú)菌去離子水中，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 PCR產(chǎn)物的克隆與基因測(cè)序 將回收純化的PCR產(chǎn)物連接到pGEM－T載體中，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)Amp、IPTG及X－gal篩選，挑取白色單菌落，過(guò)夜振搖培養(yǎng)，用質(zhì)粒抽提純化試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)BstZⅠ酶切和PCR鑒定為陽(yáng)性后，送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.6 序列分析 利用DNAStar分析軟件對(duì)本研究分離的7株CSFV流行毒株、王琴等［6］分離的1株北京順義株（BJSY2／96）及GenBank中已發(fā)表的CSFV參考毒株的E2基因部分編碼序列進(jìn)行核苷酸、氨基酸同源性比較及遺傳進(jìn)化情況分析。

2 結(jié)果

2.1 RT－PCR擴(kuò)增結(jié)果

結(jié)果顯示，7份樣品分別擴(kuò)增出了1條大小為272bp的條帶，與預(yù)計(jì)結(jié)果相符（圖1）。

圖1 豬瘟病毒E2基因RT－PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The nested RT－PCR results of CSFV E2gene

2.2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定

對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，均擴(kuò)增出一條大小為272bp的條帶，結(jié)果如圖2。

圖2 重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果Fig.2 PCR results of recombinant plasmid

2.3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

用BstZⅠ對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，酶切出的2條帶與預(yù)期的長(zhǎng)度一致（圖3）。

圖3 重組質(zhì)粒Bst ZⅠ酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Recombinant plasmid digested with Bst ZⅠ

2.4 重組質(zhì)粒的DNA序列測(cè)定與分析

對(duì)鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)得插入片段的核苷酸序列全長(zhǎng)272bp，應(yīng)用DNA Star分析軟件對(duì)本試驗(yàn)分離的7株CSFV流行毒株、王琴等分離的1株北京順義株（BJSY2／96）及GenBank中已發(fā)表的CSFV參考毒株的E2基因部分編碼序列進(jìn)行了核苷酸、氨基酸同源性比較及遺傳進(jìn)化情況分析（圖4～圖6）。

2.4.1 核苷酸、氨基酸序列分析及同源性比較 本研究分離的7株CSFV流行毒株之間核苷酸與氨基酸的同源性分別為96.3%～99.3%和95.6%～100%，與王琴等分離的1株北京順義株（BJSY2／96）（GenBank登錄號(hào)DQ907712）的核苷酸與氨基酸的同源性分別為82.4%～83.5%、81.3%～83.5%，與 CSFV Shimen 株 （GenBank 登 錄 號(hào)U72047）的核苷酸與氨基酸的同源性分別為81.7%～83.5%和82.4%～84.6%；與 HCLV 株（Gen－Bank登錄號(hào)U72048）的核苷酸與氨基酸的同源性分別為80.6%～81.7%和78.0%～80.2%，與14株來(lái)自世界不同地區(qū)的CSFV參考毒株的核苷酸與氨基酸的同源性分別為81.7%～90.1%和81.3%～93.4%。

圖4 豬瘟病毒分離株與參考株E2基因主要抗原區(qū)核苷酸序列同源性分析Fig.4 Homology analysis of the nucleotide sequences of E2major gene of CSFV isolate and reference strains

圖5 豬瘟病毒分離株與參考株E2基因主要抗原區(qū)氨基酸序列同源性分析Fig.5 Homology analysis of the amino acid sequences of E2major gene of CSFV isolate and reference strains

2.4.2 遺傳進(jìn)化關(guān)系分析 將本研究分離的7株CSFV流行毒株、王琴等分離的1株北京順義株（BJSY2／96）及 GenBank中已發(fā)表的17株 CSFV參考毒株的E2基因核苷酸相似性分析結(jié)果繪制了CSFV遺傳進(jìn)化樹(shù)。所繪制的遺傳進(jìn)化樹(shù)分為3個(gè)組群，我國(guó)的CSFV Shimen株、HCLV株及王琴等分離的1株北京順義株（BJSY2／96）均屬于基因1群，與意大利Brescia株、日本ALD株、GPE株、德國(guó)Riems株、美國(guó)Weybridge株及法國(guó)CAP株屬于同一基因群；7株北京地區(qū)近期流行的CSFV毒株均屬于基因2群，與法國(guó)Alfort株、意大利C1W株等毒株屬于同一基因群；韓國(guó)Korea 88039－1株屬于基因3群。

圖6 豬瘟病毒遺傳進(jìn)化樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of CSFV

3 討論

應(yīng)用分子流行病學(xué)研究的方法對(duì)CSFV特定基因區(qū)段核甘酸序列進(jìn)行分析，在追蹤C(jī)SFV的傳播，了解各地區(qū)CSFV的分布特點(diǎn)，監(jiān)測(cè)流行毒株之間的相關(guān)性及遺傳變異情況，指導(dǎo)臨床更為合理地防控疫病方面具有重要意義。目前在CSFV基因組序列中主要選擇E2基因、聚合酶基因（NS5B）、5′－UTR作為靶區(qū)段對(duì) CSFV 進(jìn)行基因分型研究，但以E2、NS5B分型更精確［7］。E2基因是CSFV的主要免疫相關(guān)基因。E2基因變異較大，尤其是其基因的5′端，與病毒的抗原變異有關(guān)。E2基因編碼的囊膜糖蛋白在體內(nèi)可誘導(dǎo)抗CSFV的保護(hù)性免疫［3－4］，E2區(qū)段集中了CSFV大部分的抗原表位，對(duì)此序列進(jìn)行比較分析，可對(duì)CSFV流行毒株精確分型，并從分子水平反映CSFV流行毒株主要抗原表位的變異情況。本研究采用套式RT－PCR的方法對(duì)2010年分離并鑒定的7株北京部分地區(qū)CSFV流行毒株的E2基因部分區(qū)域進(jìn)行了基因序列測(cè)定，應(yīng)用分子生物學(xué)軟件，參考CSFV國(guó)外經(jīng)典代表毒株、我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株Shimen株、疫苗株HCLV株以及20世紀(jì)90年代北京地區(qū)流行毒株的序列，進(jìn)行了同源性比較，繪制了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，對(duì)北京部分地區(qū)目前CSFV流行毒株的分子流行病學(xué)特點(diǎn)、遺傳演化現(xiàn)狀進(jìn)行了揭示，為今后更為有效預(yù)防、控制和凈化CSF提供技術(shù)參考。

本研究所分析的是CSFV E2基因5′端272bp的片段，位置相應(yīng)于Alfort株的第2 477～2 748位核苷酸。通過(guò)對(duì)CSFV各毒株E2基因核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列間的比較分析發(fā)現(xiàn)，北京部分地區(qū)2010年7株CSFV流行毒株相互之間核苷酸與氨基酸的同源性分別在96.3%、95.6%以上，而與我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株Shimen株、HCLV株及20世紀(jì)90年代北京分離株BJSY2／96之間核苷酸的同源性?xún)H為81.7%～83.5%、80.6%～81.7%和82.4%～83.5%，氨基酸的同源性也僅為82.4%～84.6%、78.0%～80.2%和81.3%～83.5%。同源性分析結(jié)果表明，7株北京地區(qū)近期流行的CSFV毒株相互之間的同源性較高，而與Shimen株、HCLV株之間存在一定的差異，與20世紀(jì)90年代北京分離株BJSY2／96之間的差異也較大。

國(guó)際上將CSFV分為3個(gè)基因群（Group）、10個(gè)基因亞群（Subgroup）［5］。CSFV 基因1群主要由20世紀(jì)80年代以前亞洲和南美洲的分離毒株組成，以Brescia株為代表；基因2群主要由20世紀(jì)80年代和90年代歐洲的分離毒株組成，以Alfort株為代表；基因3群由韓國(guó)、中國(guó)臺(tái)灣等地的獨(dú)特毒株構(gòu)成。涂長(zhǎng)春等分析了全國(guó)30個(gè)省、直轄市、自治區(qū)191個(gè)CSFV流行株E2基因變異情況，研究結(jié)果表明，中國(guó)流行毒株分為2個(gè)基因群，4個(gè)基因亞群，即2.1、2.2、2.3和1.1基因亞群，并未發(fā)現(xiàn)基因3群毒株的存在［8］。本研究將7株北京地區(qū)近期流行的CSFV毒株與CSFV參考毒株的E2基因部分編碼序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析后發(fā)現(xiàn)，20世紀(jì)90年代北京分離株BJSY2／96與我國(guó)的CSFV Shimen株、HCLV株歸屬于基因1群，而7株北京地區(qū)近期流行的CSFV毒株均屬于基因2群，且均屬于2.1亞群，在遺傳關(guān)系上接近于Italian株，與Shimen株、HCLV株相距較遠(yuǎn)，說(shuō)明，目前北京地區(qū)CSFV流行野毒株存在多樣性和復(fù)雜性。

CSFV E2蛋白約由370個(gè)氨基酸組成，存在4個(gè)獨(dú)特的抗原結(jié)構(gòu)域A、B、C、D，這4個(gè)結(jié)構(gòu)域位于E2蛋白N端第690～866氨基酸殘基之間，是E2蛋白的抗原決定區(qū)，其中變異較大的區(qū)域在第702～742氨基酸殘基之間。結(jié)構(gòu)域B、C屬于一個(gè)結(jié)構(gòu)單元，是E2的主要中和抗原區(qū)，位于第690～800氨基酸殘基之間［9－10］。本研究分析的目的片段包含E2蛋白N端第702～791氨基酸殘基，是結(jié)構(gòu)域B、C的部分片段，也是中和抗體的結(jié)合部位。E2蛋白的氨基酸序列中均含有保守的15個(gè)半胱氨酸（Cys）殘基，N 末端的6個(gè) Cys（693、737、792、818、828、856）通過(guò)形成3對(duì)二硫鍵對(duì)E2結(jié)構(gòu)的正確折疊及特異抗原決定簇的形成至關(guān)重要，其中N端的Cys693和Cys737形成一個(gè)推測(cè)的二硫鍵并固定了B區(qū)及C區(qū)的構(gòu)型［10］。本研究分析的E2蛋白區(qū)域中只包括Cys737，在7株北京CSFV流行野毒株中Cys737位點(diǎn)均未發(fā)生變異。Van Rijn等證明在B、C結(jié)構(gòu)域中705、710、713、729和734等位點(diǎn)氨基酸的變異將可能導(dǎo)致流行毒株逃脫與特定單抗的免疫反應(yīng)［11］。將本研究的7株北京CSFV流行野毒株與HCLV株、Shimen株及20世紀(jì)90年代北京分離株BJSY2／96E2蛋白的氨基酸序列進(jìn)行了對(duì)比分析，結(jié)果顯示，710位點(diǎn)所有毒株均無(wú)變化；7株北京CSFV流行野毒株與HCLV株相比，北京株存在18個(gè)共同變異的氨基酸位點(diǎn)，其中705、713、729和734位點(diǎn)均發(fā)生變異；與Shimen株相比，北京株存在14個(gè)共同變異的氨基酸位點(diǎn)，其中713、729和734位點(diǎn)均發(fā)生變異；與BJSY2／96株相比，目前的7株北京CSFV流行野毒株存在15個(gè)共同變異的氨基酸位點(diǎn)，其中705、713、729和734位點(diǎn)均發(fā)生變異。這些主要抗原位點(diǎn)的差異是否會(huì)對(duì)疫苗的免疫效果造成一定的影響還有待進(jìn)一步研究。為進(jìn)一步闡明北京地區(qū)CSFV流行毒株的遺傳變異情況，本研究還將對(duì)不同時(shí)期、不同地區(qū)的CSFV感染材料進(jìn)行連續(xù)跟蹤測(cè)定。

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