曹授俊，雷莉輝，王金秋，馬建民，孫 健

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，102442 北京）

肝臟具有生物轉(zhuǎn)化糖、脂類、蛋白質(zhì)、維生素、激素的功能和生成、分泌膽汁及攝取、轉(zhuǎn)化、排泄膽紅素的作用［1］。病原微生物侵襲、藥物的不合理應(yīng)用、過量酒精等都能引起肝臟損傷。對(duì)于肝臟損傷的預(yù)防和治療許多學(xué)者進(jìn)行了大量的研究［2-3］，為臨床用藥提供了理論依據(jù)。中藥復(fù)合劑AFF-Ⅰ口服液由天然中草藥提取而成，主要用于治療和預(yù)防肝損傷。本實(shí)驗(yàn)研究中藥復(fù)合劑AFF-Ⅰ口服液配方含量，測(cè)定中藥復(fù)合劑AFF-Ⅰ口服液對(duì)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑盒 中藥復(fù)合劑AFF-Ⅰ口服液，北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提供；聯(lián)苯雙酯滴丸（BPD），1.5mg／丸，購自北京同仁堂藥店；CCl4，分析純，使用時(shí)用花生油配制成1mL／L的濃度使用；AST、ALT、SOD、MDA 試劑盒，批號(hào)為20110620，購自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明種小鼠60只，18g～22g，雌雄各半，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器 高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司產(chǎn)品，型號(hào)為GTE22-1。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 小鼠購買后在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)2d，用于正式試驗(yàn)。飼養(yǎng)條件：室溫22℃～25℃，相對(duì)濕度65%，12h明暗交替照明，自由進(jìn)食、飲水。將60只小鼠隨機(jī)分為6組，即正常對(duì)照組、造模組、陽性藥物對(duì)照組（聯(lián)苯雙酯組）、中藥復(fù)合劑AFF-Ⅰ口服液高、中、低劑量組。試驗(yàn)開始后正常對(duì)照組、造模組分別灌服等量的生理鹽水；陽性藥物對(duì)照組按150mg／kg灌胃聯(lián)苯雙酯溶液；中藥復(fù)合劑AFF-Ⅰ口服液高、中、低劑量組分別按45、30、15mL／kg灌胃，2次／d；各給藥組連續(xù)給藥7d。末次給藥后1h，正常對(duì)照組腹腔注射花生油20mL／kg，其余組腹腔注射1mL／L CCl4花生油溶液20mL／kg。全部小鼠于末次操作后禁食不禁水，16h后小鼠眼眶取血制備血清，處死，取肝臟制備肝組織勻漿。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)

1.2.2.1 血清中AST、ALT含量的測(cè)定 小鼠眼眶取血，放入1.5mL的Eppendorf管中，水浴30min～50min，l 000r／min離心10min，取血清，按試劑盒要求，分別測(cè)定血清中AST、ALT的含量。

1.2.2.2 肝組織中SOD、MDA含量的測(cè)定 取小鼠肝0.5g，用冷生理鹽水洗去血污，加9g／L冷生理鹽水5mL制成100g／L肝勻漿，3 000r／min離心10min，取上清液2mL備用。按試劑盒的方法分別檢測(cè)肝組織中SOD、MDA含量。

2 結(jié)果

2.1 中藥復(fù)合劑AFF-Ⅰ口服液對(duì)血清中AST、ALT含量的影響

由表1可以看出，四氯化碳模型組與各組相比，血清中AST、ALT含量顯著提高，差異極顯著（P＜0.01），說明本次實(shí)驗(yàn)造模成功；與正常對(duì)照組和聯(lián)苯雙酯相比，中藥復(fù)合劑AFF-Ⅰ口服液低、中、高劑量組ALT、AST含量無顯著差異，中藥復(fù)合劑AFF-Ⅰ口服液低、中、高劑量組3組之間比較，AST、ALT含量差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 中藥復(fù)合劑AFF-Ⅰ口服液對(duì)肝組織中SOD、MDA含量的影響

表2表明，四氯化碳模型組與各組相比，血清中SOD活力顯著下降、MDA含量顯著提高，差異極顯著（P＜0.01），說明本次試驗(yàn)造模成功；與正常對(duì)照組和聯(lián)苯雙酯相比，中藥復(fù)合劑AFF-Ⅰ口服液低、中、高劑量組SOD活力、MDA含量無顯著差異，且中藥復(fù)合劑AFF-Ⅰ口服液低、中、高劑量組3組之間比較，SOD活力、MDA含量差異不顯著。

表1 中藥復(fù)合劑AFF-Ⅰ口服液對(duì)血清中AST、ALT含量的影響（±sD n=10）Table 1 Effect of AFF-Ⅰon serum content of AST and ALT

表1 中藥復(fù)合劑AFF-Ⅰ口服液對(duì)血清中AST、ALT含量的影響（±sD n=10）Table 1 Effect of AFF-Ⅰon serum content of AST and ALT

注：表中肩標(biāo)相同者為差異不顯著，肩背不相同者為差異極顯著（P＜0.01）。Note：In the table，it indicates that it has insignificant difference with the same marks and very significant difference with different marks（P＜0.01）.

組別Groups天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶／（U·L-1）AST丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶／（U·L-1）ALT對(duì)照組Control group 169.3±27.97 35.92±6.64四氯化碳組CCl4group 361.93a±64.32 111.98a±17.59聯(lián)苯雙酯組Bifendate group 169.94±72.52 39.10±5.53低劑量組Low dose group 200.05±41.19 40.65±4.41中劑量組Medium dose group 200.50±37.26 42.51±4.67高低劑量組High dose group 195.82±39.22 40.88±9.07

表2 中藥復(fù)合劑AFF-Ⅰ口服液對(duì)肝組織中SOD、MDA含量的影響（±sD n=10）Table 2 Effect of AFF-1on liver content of SOD and MDA

表2 中藥復(fù)合劑AFF-Ⅰ口服液對(duì)肝組織中SOD、MDA含量的影響（±sD n=10）Table 2 Effect of AFF-1on liver content of SOD and MDA

注：表中肩標(biāo)相同者為差異不顯著，肩背不相同者為差異顯著（P＜0.01）。Note：In the table，it indicates that it has insignificant difference with the same marks and very significant difference with different marks（P＜0.01）.

超氧化物歧化酶／（IU·mL-1）SOD丙二醛／（μmol·L-1）MDA組別Groups對(duì)照組Contro group 28.55±1.21 5.33±0.54四氯化碳組CCl4group 19.58a±4.02 8.82a±1.40聯(lián)苯雙酯組Bifendate group 28.31±2.07 5.12±1.05低劑量組Low dose group 26.58±1.86 6.05±0.67中劑量組Medium dose group 27.21±2.46 5.76±0.94高低劑量組High dose group 27.11±2.65 5.39±1.38

3 討論

CCl4是經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)性肝損傷動(dòng)物模型所用毒劑，一般認(rèn)為［4］肝損傷是CCl4進(jìn)入肝細(xì)胞后，由于脂質(zhì)過氧化使線粒體膜脂質(zhì)溶解，從而影響線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，使酶蛋白質(zhì)合成減少，致使肝細(xì)胞變性、壞死。肝細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化是CCl4介導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷的主要機(jī)制，目前認(rèn)為脂質(zhì)過氧化損傷與自由基生成增多或清除減少有關(guān)。SOD是體內(nèi)清除自由基、抑制自由基反應(yīng)的物質(zhì)之一，它能抑制黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶，減少自由基的產(chǎn)生，減輕肝細(xì)胞的損傷，其活性降低則會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)氧自由基的積累，引發(fā)質(zhì)膜的過氧化作用，使膜結(jié)構(gòu)與功能受到損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡［5］。不管是急性、亞急性還是慢性CCl4肝損傷，動(dòng)物肝的SOD活性均明顯降低［6］，仇君等［7］在研究茵梔黃口服液對(duì)免疫性肝損傷具有保護(hù)作用時(shí)，認(rèn)為其作用機(jī)制可能與抑制體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)、促進(jìn)自由基清除、調(diào)節(jié)免疫功能有關(guān)。

本試驗(yàn)利用CCl4導(dǎo)致小鼠急性肝損傷評(píng)價(jià)中藥復(fù)合劑AFF-Ⅰ口服液對(duì)肝臟保護(hù)作用，結(jié)果表明，中藥復(fù)合劑AFF-Ⅰ口服液低、中、高劑量組能顯著降低CCl4導(dǎo)致小鼠急性肝損傷血清中AST、ALT含量（P＜0.01），顯著降低CCl4所致急性肝損傷小鼠肝組織MDA含量，提高肝組織SOD活力，與聯(lián)苯雙酯組比較無顯著差異，說明中藥復(fù)合劑AFF-Ⅰ口服液對(duì)CCl4所致小鼠的急性肝損傷具有保護(hù)作用。中藥復(fù)合劑AFF-Ⅰ口服液對(duì)肝損傷保護(hù)作用的作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

［1］ 孫 蓉，楊 倩，黃 偉，等，肝功能相關(guān)指標(biāo)在中藥肝毒性損傷中作用與毒性相關(guān)程度分析［J］.中國藥理與臨床，2008，24（6）：82-84.

［2］ Yao D，Vlessidis A G，Gou Y et al.Chemiluminescence detection of superoxide anion release and superoxide dismutase activity：modulation effect of Pulsatilla chinensis［J］.Anal Bioanal Chem ，2004，379（1）：171-177.

［3］ Liu C F，Lin C H，Lin C C，et al.Antioxidative natural product protect against econazole-induced liver injuries［J］.Toxicology，2004，196（1-2）：87-93.

［4］ Henderson N C，F(xiàn)orbes S J.Hepatic fibrogenesis：from within and outwith［J］.Toxicology，2008，254（3）：130.

［5］ Lee A S.The E R chaperone and signaling regulator GRP78PBiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress［J］.Methods，2005，35（4）：373-381.

［6］ Moselhy S S，Ali H K.Hepatoprotective effect of cinnamon extracts against carbon tetrachloride induce oxidative stress and liver injury in rats［J］.Biol Res，2009，42（1）：93.

［7］ 仇 君，何榮芬，高 亮，等，茵梔黃口服液在免疫性肝損傷中的作用研究［J］.中國藥房，2010，21（27）：2510-2512.