鄭國灣，董勝張，俞曉平

（中國計(jì)量學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江省生物計(jì)量與檢驗(yàn)檢疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310018）

肌動蛋白（actin）是一種廣泛存在于真核生物細(xì)胞中的多功能球狀蛋白，由單個亞基構(gòu)成，主要分為：參與細(xì)胞骨架組成的微絲，參與肌肉細(xì)胞的收縮的肌細(xì)絲［1，2］.肌動蛋白是一類高度保守的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列在各個物種間的差異不超過20%，是細(xì)胞內(nèi)的管家基因.肌動蛋白參與許多重要的細(xì)胞生理過程，包括肌肉收縮，細(xì)胞運(yùn)動，細(xì)胞分裂，細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞連接建立和細(xì)胞形態(tài)維持等［1，3］.作為細(xì)胞內(nèi)的管家基因，肌動蛋白在生物體內(nèi)的生理或者受刺激狀態(tài)下都保持持續(xù)恒量表達(dá)，因此在許多量化實(shí)驗(yàn)中，如實(shí)時熒光定量PCR，半定量RTPCR，Western blot和Northern blot雜交中均作為內(nèi)參基因［4］.

福壽螺Pomacea canaliculata（Lamarck），又名蘋果螺、大瓶螺，是一種大型的淡水螺類，隸屬于軟體動物門（Mollusca）、腹足綱（Gastropoda）、新進(jìn)腹足目（Caenogastropoda）的瓶螺科（Ampullariidae）.福壽螺原產(chǎn)于南美洲亞馬遜流域，因其被高估的經(jīng)濟(jì)價值在20世紀(jì)80年代相繼被亞洲許多國家引進(jìn)并飼養(yǎng)［5］.福壽螺適應(yīng)能力強(qiáng)，繁殖快，食性雜，在食物充足并缺乏有效天敵的環(huán)境中能迅速建立起種群，并成為當(dāng)?shù)厣锶郝涞膬?yōu)勢種［6，7］.福壽螺喜食水稻幼苗及其它水生作物，現(xiàn)已成為我國及其他亞洲國家嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)有害生物之一［7，8］.

然而迄今為止，有關(guān)福壽螺β－actin基因的研究尚未見報(bào)道.本研究成功地克隆了入侵我國的福壽螺β－actin片段cDNA，并分析了其序列組成.通過檢測其在鰓、消化腺、腎和足部肌肉組織等中的表達(dá)情況，為以后研究福壽螺其它功能基因提供了分子內(nèi)標(biāo).此外，分析福壽螺β－actin基因片段序列與其他物種序列的差異性，并采用NJ法同其它相近物種構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，初步探討福壽螺與其它物種的親緣關(guān)系，為福壽螺的入侵和危害提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 樣品采集和處理

成年福壽螺采自浙江余姚茭白田間.所有福壽螺個體在恒溫實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行缸養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為（26±1）℃，光照D∶L＝12h∶12h，喂養(yǎng)食料為新鮮白菜葉.在實(shí)驗(yàn)前，所有采集的福壽螺進(jìn)行至少10d以上的馴養(yǎng).挑取健康福壽螺，進(jìn)行24h饑餓處理后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn).

1.2 主要試劑

Trizol?reagent購自美國Invitrogen公司；PrimeScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit，LA－Taq DNA 聚合酶，r－Taq DNA 聚合酶，DL2000DNA Marker，pMD－18Tvector購 自TaKaRa公司；Gel Extraction kit購自Axygen公司；其它試劑均為分析純，所用水均為超純水.

1.3 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

取福壽螺鰓、消化腺、腎和足部肌肉鮮活組織，按照Trizol試劑操作說明書抽提總RNA，電泳檢測其完整性，通過核酸定量儀檢測其濃度和純度，以保證其OD260／OD280在1.8到2.0的范圍內(nèi).按照反轉(zhuǎn)錄PrimeScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書合成第一鏈cDNA.

1.4 福壽螺β－actin cDNA片段序列的獲得

根據(jù)GenBank中的相近種光滑雙臍螺Biomphalaria glabrata（登錄號：U53348），盤鮑螺Haliotis discus（登錄號：EF103363），文蛤 Meretrix meretrix（登 錄 號：JN084197），櫛 孔 扇 貝Chlamys farreri（登錄號：AY335441），紫貽貝Mytilus galloprovincialis（登錄號：AF157491）的β－actin cDNA序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡并引物actin－F和actin－R，用于來擴(kuò)增β－actin的cDNA 片段.PCR 反應(yīng)體系為：5μl 10×PCR Buffer（Mg2＋Plus），4 μl dNTP Mixture （each 2.5mM），2μl模板cDNA正反引物（10μM）各1μl，TaKaRa Taq（5U／μl）0.25μl，加ddH2O至50μl.擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；然后94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min.所得的PCR產(chǎn)物均用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收后，連接到pMD－18T，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH－5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取的陽性克隆送至上海博尚生物有限公司測序.

1.5 序列分析和數(shù)據(jù)處理

通過美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）的BLAST功能，鑒定獲得的β－actin cDNA全長是否屬于相應(yīng)的actin基因家族.使用DNAMAN軟件，將根據(jù)β－actin cDNA推測出的編碼框氨基酸序列同其它部分已知物種相應(yīng)的β－actin氨基酸序列進(jìn)行同源性比對，并且使用 MEGA 5.0（Neighbor－Joining）構(gòu)建了相應(yīng)的生物系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用Bootstrap（重復(fù)數(shù)1000）檢驗(yàn)分子系統(tǒng)樹各分支的置信度.

1.6 福壽螺β－actin基因在4個組織中的轉(zhuǎn)錄水平

根據(jù)獲得的β－actin基因核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對特異性引物actin－F和actin－R：5′－TCACCAT TGGCAACGAGAGAT－3′和5′－TCTCGTGA ATACCAGCCGACT－3′，對福壽螺鰓組織cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對退火溫度及循環(huán)次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，獲得適宜的實(shí)驗(yàn)參數(shù).采用優(yōu)化后的反應(yīng)體系對福壽螺鰓、消化腺、腎和足部肌肉組織的RNA進(jìn)行半定量PCR檢測.PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；然后94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共28個循環(huán)；最后72℃延伸10 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測.

2 結(jié)果與分析

2.1 序列特征分析

經(jīng)RT－PCR擴(kuò)增，電泳后獲得福壽螺β－actin基因片段清晰單一的擴(kuò)增產(chǎn)物（圖1）.序列測定表明福壽螺β－actin基因序列長度為840bp，與電泳圖預(yù)測大小一致.其推導(dǎo)的氨基酸序列（280個）均為β－actin基因開放閱讀框的一部分（圖2）.

圖1 福壽螺β－actin擴(kuò)增電泳圖譜Figure 1 PCR amplification ofβ－actin in apple snail

圖2 福壽螺β－actin基因片段核苷酸序列及其推導(dǎo)氨基酸序列Figure 2 Nucleotide and deduced amino acid sequences ofβ－actin cDNA fragment

福壽螺β－actin基因片段推導(dǎo)的氨基酸序列在NCBI中經(jīng)過BLAST搜索，與其他已知物種β－actin基因進(jìn)行同源性比較.發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列與其他已知相近物種基因的部分片段或全長具有高度同源性94%～98%（表1），且與軟體動物間具有更高的同源性.

表1 福壽螺β－actin基因推導(dǎo)的片段氨基酸序列同源性比較Table 1 Identity comparison of the amino acid sequences of theβ－actin cDNA fragments in apple snail

基于福壽螺β－actin推導(dǎo)氨基酸序列及表1物種的序列，采用MEGA 5.0軟件以NJ法構(gòu)建了8種動物的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）.福壽螺與軟體動物門的其他物種聚為一簇，然后與節(jié)肢動物聚為一簇，再與脊椎動物聚為一簇.

圖3 根據(jù)部分β－actin氨基酸序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 3 Phylogenetic tree of amino acids sequences of β－actin genes constructed with the neighborjoining method

2.2 福壽螺β－actin基因的表達(dá)分析

在優(yōu)化的PCR條件下，使用RT－PCR檢測福壽螺β－actin基因在其鰓、消化腺、腎和足部肌肉等組織的轉(zhuǎn)錄水平.電泳結(jié)果（圖4）顯示β－actin基因在這四個組織中的表達(dá)基本一致，具有良好的穩(wěn)定性，表明該基因適合作為內(nèi)參基因.

圖4 福壽螺四種組織β－actin基因的RT－PCR檢測Figure 4 Relative expression ofβ－actin mRNAs in four different tissues

3 討 論

本研究采用簡并PCR成功地獲得了福壽螺β－actin基因部分cDNA序列，這是在淡水螺類中是首次報(bào)道.目前對軟體動物β－actin基因的研究主要集中在海水貝類等經(jīng)濟(jì)軟體動物，如太平洋牡蠣（C.giga）［9］、蝦夷扇貝（Patinopecten yessoens）［10］、皺紋盤鮑（H.discus hannai）［11］等.本次得到的福壽螺β－actin氨基酸序列不但與太平洋牡蠣、光滑雙臍螺（B.glabrata）等軟體動物具有很高的相似性，而且與果蠅（D.melanogaster）、斑馬魚（D.rerio）、大鼠（R.norvegicus）等動物也有較高的相似性，這符合β－actin基因氨基酸編碼區(qū)高度保守的特點(diǎn)［4，12］，可能與它參與構(gòu)成細(xì)胞骨架等重要功能密切相關(guān).

β－actin基因一直以來被作為內(nèi)參基因廣泛應(yīng)用于基因的相對表達(dá)實(shí)驗(yàn)中.本實(shí)驗(yàn)從半定量PCR得到的結(jié)果表明，福壽螺β－actin基因在鰓、消化腺、腎和足部肌肉組織等組織中表達(dá)基本一致，并具有良好的穩(wěn)定性.軟體動物分子生物學(xué)研究中，β－actin基因仍是最常用的內(nèi)參基因，如櫛孔扇貝（C.farreri）［13］、皺紋盤鮑（H.discus hannai）［14］、合浦珠母貝 （Pinctada fucata）［15］等，而且表達(dá)穩(wěn)定.因此，只要通過在福壽螺表達(dá)試驗(yàn)中β－actin基因是否受到實(shí)驗(yàn)操作的影響的研究，就可以判定該基因是否可以作為研究福壽螺其他功能基因相對表達(dá)的內(nèi)參基因.

［1］RUBENSTEIN P A.The functional importance of multiple actin isoforms［J］.BioEssays，1990，12（7）：309－315.

［2］KABSCH W，VANDEKERCKHOVE J.Structure and function of actin［J］.Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure，1992，21（1）：49－76.

［3］POLLARD T D，COOPER J A.Actin and actin－binding proteins.A critical evaluation of mechanisms and functions［J］.Annual Review of Biochemistry，1986，55（1）：987－1035.

［4］ZHONG H，SIMONS J W.Direct comparison of GAPDH，β－Actin，cyclophilin，and 28SrRNA as internal standards for quantifying RNA levels under hypoxia［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，1999，259（3）：523－526.

［5］JOSHI R C.Problems with the management of the golden apple snail Pomacea canaliculata：an important exotic pest of rice in Asia ［M］.Springer：Netherlands，2007：257－264.

［6］YUSA Y，SUGIURA N，WADA T.Predatory potential of freshwater animals on an invasive agricultural pest，the apple snail Pomacea canaliculata （Gastropoda：Ampullariidae），in Southern Japan［J］.Biological Invasions，2006，8（2）：137－47.

［7］DONG S Z，ZHENG G W，YU X P，et al.Biological control of golden apple snail，Pomacea canaliculata by Chinese soft－shelled turtle，Pelodiscus sinensis in the wild rice，Zizania latifoliafield［J］.Scientia Agricola，2012，69：142－146.

［8］CARLSSON N O L，BR?NMARK C，HANSSON L A.Invading herbivory：the golden apple snail alters ecosystem functioning in asian wetlands［J］.Ecology，2004，85（6）：1575－1580.

［9］MIYAMOTO H，HAMAGUCHI M，OKOSHI K.Analysis of genes expressed in the mantle of oyster Crassostrea gigas［J］.Fisheries Science，2002，68（3）：651－658.

［10］劉衛(wèi)東，赫崇波，劉 形，等.蝦夷扇貝肌動蛋白基因cDNA序列克隆與分析［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2008，27（10）：519－522.

［11］張志峰，茅云翔，潘 潔，等.皺紋盤鮑肌動蛋白基因啟動子的克隆和序列分析［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2001，25（5）：398－401.

［12］MA H M，MAI K S，LIUFU Z G，et al.Cloning and characterization of an actin gene of the scallop Chlamys farreri and the phylogenetic analysis of mollusk actins［J］.Chinese Journal of Oceanology and Limnology，2007，25（3）：304－309.

［13］胥 煒，王 昊，宋林生，等.櫛孔扇貝C型凝集素基因的克隆與表達(dá)研究［J］.高技術(shù)通訊，2005，15（1）：83－88.

［14］MA H M，XU W，MAI K S，et al.Cloning and characterization of an abalone（Haliotis discus hannai）actin gene［J］.Journal of Ocean University of China（English Edition），2004，3（2）：145－149.

［15］WANG Z L，WU Z H，JIAN J C，et al.Cloning and expression of an actin gene in the haemocytes of pearl oyster（Pinctada fucata，Gould 1850）［J］.Marine Genomics，2008，1（2）：63－67.