叔丁基對(duì)苯二酚兩種代謝物的代謝動(dòng)力學(xué)

郝鵬鵬，倪晉仁，孫衛(wèi)玲

(1.首都經(jīng)濟(jì)貿(mào)易大學(xué)安全與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100070；2.北京大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，北京 100871)

叔丁基對(duì)苯二酚兩種代謝物的代謝動(dòng)力學(xué)

郝鵬鵬1，倪晉仁2，孫衛(wèi)玲2

(1.首都經(jīng)濟(jì)貿(mào)易大學(xué)安全與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100070；2.北京大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，北京 100871)

目的：研究叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)在Sprague-Dawley大鼠體內(nèi)的兩種代謝物叔丁基對(duì)苯二酚-硫酸結(jié)合物和叔丁基對(duì)苯二酚-葡萄糖醛酸結(jié)合物的代謝動(dòng)力學(xué)特征。方法：大鼠灌胃不同劑量叔丁基對(duì)苯二酚后，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分別對(duì)兩種代謝物在不同時(shí)間點(diǎn)血清中的濃度進(jìn)行半定量分析，并運(yùn)用實(shí)用藥代動(dòng)力學(xué)軟件進(jìn)行房室模型擬合及代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算。結(jié)果：兩種代謝物在大鼠體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)過(guò)程均呈一級(jí)動(dòng)力學(xué)特征，符合二室模型。結(jié)論：灌胃后，叔丁基對(duì)苯二酚-硫酸結(jié)合物、叔丁基對(duì)苯二酚-葡萄糖醛酸結(jié)合物在大鼠體內(nèi)達(dá)到峰值濃度的時(shí)間分別為0.17～0.61h、0.23～0.74h，分布相半衰期分別為0.32～1.11h、0.26～2.60h，消除相半衰期分別為11.75～24.54h、24.42～55.78h。雄性大鼠血清中兩種代謝物的濃度顯著高于雌性大鼠。兩種代謝物在大鼠體內(nèi)的暴露濃度均以低于與劑量呈正比的方式增加，隨著劑量的升高，叔丁基對(duì)苯二酚在大鼠體內(nèi)的代謝飽和。

叔丁基對(duì)苯二酚-硫酸結(jié)合物；叔丁基對(duì)苯二酚-葡萄糖醛酸結(jié)合物；代謝動(dòng)力學(xué)；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

叔丁基對(duì)苯二酚(tertiary butylhydroquinone，TBHQ)是一種廣泛應(yīng)用于油脂食品的合成酚類抗氧化劑(synthetic phenolic antioxidants，SPAs)。然而，其安全性評(píng)價(jià)結(jié)論一直存在爭(zhēng)議，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[1-2]和體外實(shí)驗(yàn)[3-7]顯示TBHQ具有一定的毒性。此外，體內(nèi)代謝研究發(fā)現(xiàn)TBHQ在體內(nèi)的代謝物有TBHQ-硫酸結(jié)合物、TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物、TBHQ-谷胱甘肽結(jié)合物和叔丁基對(duì)苯醌(2-tert-butyl-1,4-benzoquinone，TBQ)等[1,6,8]。其中，TBHQ-谷胱甘肽結(jié)合物已被發(fā)現(xiàn)對(duì)腎臟和膀胱有毒[9]，TBQ和TBHQ-谷胱甘肽結(jié)合物都具有細(xì)胞毒性[6,10]因此，TBHQ在食品中的添加引起社會(huì)廣泛關(guān)注[11]。目前，很多國(guó)家對(duì)其使用加以限制，我國(guó)規(guī)定TBHQ在食品中的最大添加量為200mg/kg[12]，而日本則不允許在食品中使用TBHQ[13]。

本實(shí)驗(yàn)擬運(yùn)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀建立檢測(cè)大鼠血清中TBHQ-硫酸結(jié)合物和TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物的分析方法，探討兩種代謝物在大鼠體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)過(guò)程，為深入研究TBHQ及其代謝物的毒作用性質(zhì)進(jìn)而評(píng)價(jià)TBHQ的安全性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成年Sprague-Dawley大鼠，雌性和雄性，體質(zhì)量(160±10)g，購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，合格證號(hào)SCXK(京)2002-0003。

TBHQ標(biāo)準(zhǔn)樣品(純度98.0%) 德國(guó)J&K Chemica公司；TBHQ(食品級(jí)，純度＞96.0%) 廣州泰邦食品添加劑有限公司；甲醇(色譜純) 美國(guó)Fisher Scientific公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HP 1100 LC-MSD Trap SL System高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器(diode-array detector，DAD)、電噴霧電離源(electrospray ionization，ESI)美國(guó)Agilent公司；BP210S、BP211D電子分析天平德國(guó)Sartorius公司；MILLI-Q GRADIENT SYSTEM超純水機(jī) 美國(guó)Millipore公司；WH-90A型微型混合器上海亞榮生化儀器廠；TGL-16C型高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 劑量與樣品采集

FAO/WHO食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)(Joint FAO/ WHO Expert Committee on Food Additives，JECFA)規(guī)定每日允許攝入量(acceptable daily intake，ADI)為0～0.7mg/kg[6]。動(dòng)物對(duì)毒性的耐受力比人強(qiáng)，約為人的1～10倍[14]。因此，選取7mg/kg作為低劑量。TBHQ的口服半致死量(LD50)為700～1000mg/kg[1]，因此選用700mg/kg作為高劑量。中等劑量選取低劑量和高劑量的中間值，定為350mg/kg。

雌、雄大鼠各24只，每6只一組，隨機(jī)分組：雌鼠A、B、C、D組和雄鼠A、B、C、D組。A組為空白對(duì)照組，以1mL玉米油灌胃；B、C、D組的劑量分別為7、350、700mg/kg，以1mL玉米油溶解后灌胃。大鼠灌胃后，分別于0.08、0.25、0.5、1、2、3、5、7、9、12、24、48h尾靜脈采血0.2mL。所采血樣放在冰盒中，置于4℃冰箱。

1.4 樣品前處理

空白血清：空白血樣在12000r/min離心20min，移取上清液到1.5mL具塞離心管中，即為空白血清。

血清供試品溶液：血樣在12000r/min離心20min，移取上清液100μL到1.5mL具塞離心管中，加入100μL超純水，于微型混合器上振蕩1min，加入200μL甲醇，于微型混合器上振蕩3min，12000r/min離心20min，移取100μL上清液至內(nèi)置100μL內(nèi)插管的液相色譜進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

血清標(biāo)準(zhǔn)溶液：用空白血清配制TBHQ質(zhì)量濃度分別為49、228、581、1372、2515、5030μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入100μL超純水，于微型混合器上振蕩1min，加入1mL乙酸乙酯，于微型混合器上振蕩3min，12000r/min離心20min，移取800μL萃取液至1.5mL離心管中，在25℃條件下由氮?dú)饩徛蹈桑?00μL甲醇定容，轉(zhuǎn)移至放有100μL內(nèi)插管的液相色譜進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)，即得TBHQ血清標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.5 液相色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱ZORBAX Eclipse XDB-C18(2.1mm× 150mm，5μm)，柱溫30℃，流動(dòng)相為甲醇-水(體積比為60:40)，流速0.15mL/min，進(jìn)樣體積5μL，檢測(cè)波長(zhǎng)290nm，停止時(shí)間25min。

質(zhì)譜條件：碰撞氣為氦氣，霧化氣和干燥氣為氮?dú)猓F化氣壓力30psi，干燥氣流速10L/min，干燥氣溫度280℃，毛細(xì)管電壓3000V，負(fù)離子檢測(cè)模式，質(zhì)量掃描范圍m/z 50～450。

1.6 動(dòng)力學(xué)模型計(jì)算

運(yùn)用實(shí)用藥代動(dòng)力學(xué)軟件(practical pharmacokinetic program-version 97，中國(guó)藥理學(xué)會(huì)數(shù)學(xué)專業(yè)委員會(huì)編制)分別對(duì)TBHQ-硫酸結(jié)合物和TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物在大鼠血清中的平均濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行模型擬合，并估算各代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)值，采用Excel軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)或相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠血清中TBHQ兩種代謝物的檢測(cè)

圖1 一級(jí)質(zhì)譜總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of rat serum and extracted ion chromatograms of TBHQ, TBHQ-sulfate and TBHQ-glucuronide

在所采用的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用條件下，TBHQ的保留時(shí)間為5.3min(圖1)，分子離子為m/z 165，二級(jí)質(zhì)譜主要碎片離子為m/z 149、m/z 108，質(zhì)譜裂解途徑詳見(jiàn)文獻(xiàn)[15]；TBHQ-硫酸結(jié)合物的保留時(shí)間為3.4min (圖1)，分子離子為m/z 245，二級(jí)質(zhì)譜主要碎片離子為m/z 165、m/z 81，對(duì)m/z 165作三級(jí)質(zhì)譜，主要碎片離子為m/z 149、m/z 108，質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖2A；TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物的保留時(shí)間為3.4min(圖1)，分子離子為m/z 341，二級(jí)質(zhì)譜主要碎片離子為m/z 113、m/z 165和 m/z 175，對(duì)m/z 165作三級(jí)質(zhì)譜，主要碎片離子為m/z 149、m/z 108，質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖2B。

圖2 TBHQ-硫酸結(jié)合物(A) 和TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物(B)的質(zhì)譜裂解途徑Fig.2 MS fragmentation pathways of TBHQ-sulfate and TBHQ-glucuronide

在研究TBHQ-硫酸結(jié)合物和TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物的體內(nèi)動(dòng)力學(xué)過(guò)程時(shí)，與血清中濃度的絕對(duì)值相比，更為關(guān)注的是血清中濃度的相對(duì)變化。因此，在沒(méi)有代謝物標(biāo)準(zhǔn)樣品的情況下，利用TBHQ標(biāo)準(zhǔn)樣品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)大鼠血清中兩種代謝物的質(zhì)量濃度作半定量分析。質(zhì)量濃度范圍為49～5030μg/L時(shí)，以TBHQ的一級(jí)質(zhì)譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，TBHQ的質(zhì)量濃度(χ)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為y＝703χ＋3582 (R2＝0.9935)，依據(jù)該方程和TBHQ-硫酸結(jié)合物、TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物的一級(jí)質(zhì)譜峰面積分別求質(zhì)量濃度，由此得出大鼠血清中TBHQ-硫酸結(jié)合物和TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物的平均濃度-時(shí)間曲線(圖3、4)。此外，當(dāng)灌胃劑量為700mg/kg時(shí)，雄性大鼠(n＝6)組有2只灌胃1～2h后死亡，雌性大鼠(n＝6)組則沒(méi)有死亡現(xiàn)象，據(jù)此推斷雌性大鼠對(duì)TBHQ的耐受能力更強(qiáng)。

圖3 血清中TBHQ-硫酸結(jié)合物的平均濃度-時(shí)間曲線Fig.3 Mean concentration-time profiles of TBHQ-sulfate in rat serum

圖4 血清中TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物的平均濃度-時(shí)間曲線Fig.4 Mean concentration-time profiles of TBHQ-glucuronide in rat serum

2.2 大鼠血清中TBHQ兩種代謝物的代謝動(dòng)力學(xué)

分別對(duì)TBHQ-硫酸結(jié)合物和TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物在大鼠血清中的平均濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，結(jié)果表明：兩種代謝物在大鼠體內(nèi)的代謝過(guò)程均符合一級(jí)吸收速率的二室模型，回歸系數(shù)(R2)分別為0.82～0.98、0.75～0.99。動(dòng)力學(xué)方程為c＝Aeˉαt＋Beˉβt(A＋B)eˉKat。其中，c為T(mén)BHQ在大鼠血清中的濃度，α為分布速率常數(shù)，β為消除速率常數(shù)，A為α相在縱軸的截距，B為β相在縱軸的截距，Ka為一級(jí)吸收速率常數(shù)，t為時(shí)間。大鼠體內(nèi)TBHQ-硫酸結(jié)合物和TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物的主要代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)值分別見(jiàn)表1、2。

表1 TBHQ-硫酸結(jié)合物在大鼠體內(nèi)的主要代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Main metabolic kinetic parameters of TBHQ-sulfate in rat serum

表2 TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物在大鼠體內(nèi)的主要代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Main metabolic kinetic parameters of TBHQ-glucuronide in rat serum

3 討 論

灌胃后，TBHQ在大鼠體內(nèi)代謝生成TBHQ-硫酸結(jié)合物(t1/2Ka為0.04～0.26h)和TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物(t1/2Ka為0.08～0.36h)；當(dāng)時(shí)間分別為0.17～0.61h、0.23～0.74h時(shí)，兩種代謝物在血液中的濃度達(dá)到峰值；并且，從血液分布到體內(nèi)其他組織或器官中(t1/2α(TBHQ-硫酸結(jié)合物)為0.32～1.11h、t1/2α(TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物)為0.26～2.60h)；最終，兩種代謝物從血液中消除(t1/2β(TBHQ-硫酸結(jié)合物)為11.75～24.54h、t1/2β(TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物)為24.42～55.78h)。

當(dāng)灌胃劑量為7、350、700mg/kg時(shí)，分別對(duì)大鼠血清中TBHQ-硫酸結(jié)合物和TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物的濃度進(jìn)行性別差異分析，t檢驗(yàn)結(jié)果均為P＜0.01。因此，在TBHQ的體內(nèi)代謝過(guò)程中，大鼠血清中兩種代謝物的濃度存在著顯著性性別差異，雄性大鼠體內(nèi)兩種代謝物的濃度均高于雌性大鼠。該差異是造成高劑量時(shí)雄性大鼠出現(xiàn)死亡的原因之一，仍需進(jìn)一步的毒理實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

運(yùn)用Power模型[16]討論TBHQ-硫酸結(jié)合物和TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物的體內(nèi)暴露濃度(cmax)與劑量(c)間的關(guān)系，公式為lncmax=a＋blnc，c為劑量，b為體內(nèi)暴露濃度-劑量的比例常數(shù)，b=1表示體內(nèi)暴露濃度與劑量呈正比。經(jīng)估算，在雌性、雄性大鼠體內(nèi)，b(TBHQ-硫酸結(jié)合物)值分別為0.78、0.83，b(TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物)值分別為0.51、0.64。因此，當(dāng)灌胃劑量從7mg/kg增至700mg/kg時(shí)，兩種代謝物在大鼠體內(nèi)的暴露濃度均以低于與劑量呈正比的方式增加，劑量升高時(shí)，TBHQ的代謝反應(yīng)受到參與反應(yīng)的酶或底物的限制而出現(xiàn)代謝飽和現(xiàn)象。

[1]IKEDA G J, SAPIENZA P P, ROSS I A. Distribution and excretion of radiolabelled tert-butylhydroquinone in Fischer 344 rats[J]. Food and Chemical Toxicology, 1998, 36(11): 907-914.

[2]PATRICK E, JUBERG D R, O,DONOGHUE J, et al. Depigmentation with tert-butyl hydroquinone using black guinea pigs[J]. Food and Chemical Toxicology, 1999, 37(2/3): 169-175.

[3]KASHANIAN S, DOLATABADI J E. DNA binding studies of 2-tertbutylhydroquinone(TBHQ) food additive[J]. Food Chemistry, 2009, 116(3): 743-747.

[4]LI Y, SEACAT A, KUPPUSAMY P, et al. Copper redox-dependent activation of 2-tert-butyl(1,4) hydroquinone: formation of reactive oxygen species and induction of oxidative DNA damage in isolated DNA and cultured rat hepatocytes[J]. Mutation Research, 2002, 518(2): 123-133.

[5]DOLATABADI J E N, KASHANIAN S. A review on DNA interaction with synthetic phenolic food additives[J]. Food Research International, 2010, 43(5): 1223-1230.

[6]OKUBO T, YOKOYAMA Y, KANO K, et al. Cell death induced by the phenolic antioxidant tert-butylhydroquinone and its metabolite tertbutylquinone in human monocytic leukemia U937 cells[J]. Food and Chemical Toxicology, 2003, 41(5): 679-688.

[7]SHAHABADI N, MAGHSUDI M, KIANI Z, et al. Multispectroscopic studies on the interaction of 2-tert-butylhydroquinone (TBHQ), a food additive, with bovine serum albumin[J]. Food Chemistry, 2011, 124 (3): 1063-1068.

[8]郝鵬鵬, 孫衛(wèi)玲, 黃文, 等. 叔丁基對(duì)苯二酚在大鼠體內(nèi)的代謝研究[J]. 毒理學(xué)雜志, 2007, 21(1): 30-33.

[9]PETERS M M, RIVERA M I, JONES T W, et al. Glutathione conjugates of tert-butyl-hydroquinone, a metabolite of the urinary tract tumor promoter 3-tert-butyl-hydroxyanisole, are toxic to kidney and bladder [J]. Cancer Research, 1996, 56(5): 1006-1011.

[10]HAENEN H E M G, BLEIJLEVENS E, ELZERMAN H, et al. Cytotoxicity of 2-tert-butyl hydroquinone glutathione conjugates after apical and basolateral exposure of rat renal proximal tubular cell monolayers[J]. Toxicology in Vitro, 1996, 10(2): 141-148.

[11]黃小希. 麥當(dāng)勞麥樂(lè)雞抽檢結(jié)果公布[N]. 中國(guó)質(zhì)量報(bào), 2010-07-23 (005).

[12]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部, 中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GB2760—2007食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008.

[13]丁磊. 堅(jiān)果與炒貨食品中抗氧化劑的測(cè)定方法研究[D]. 合肥: 安徽大學(xué), 2010.

[14]許崇輝. 影響動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)雜志, 2002, 12(3): 180-182.

[15]HAO Pengpeng, NI Jinren, SUN Weiling, et al. Determination of tertiary butylhydroquinone in edible vegetable oils by liquid chromatography/ion trap mass spectrometry[J]. Food Chemistry, 2007, 105(4): 1732-1737.

[16]LIU Zhen, SHA Yunfei, HUANG Taomin, et al. High-performance liquid chromatographic determination of vertilmicin in rat plasma using sensitive fluorometric derivatization[J]. Journal of Chromatography B, 2005, 828(1/2): 2-8.

Metabolic Kinetics of Two Metabolites from Tertiary Butylhydroquinone

HAO Peng-peng1，NI Jin-ren2， SUN Wei-ling2
(1. School of Safety and Environmental Engineering, Capital University of Economics and Business, Beijing 100070, China；2. College of Environmental Sciences and Engineering, Peking University, Beijing 100871, China)

Objective: The metabolic kinetics of two metabolites from tertiary butylhydroquinone, tertiary butylhydroquinonesulfate and tertiary butylhydroquinone-glucuronide were investigated in rats. Methods: The concentrations of the metabolites in the serum of rats after oral exposure of tertiary butylhydroquinone were semi-quantitatively analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Compartment model and metabolic kinetic parameters were evaluated by practical pharmacokinetic program. Results: The serum concentration-time profiles of two metabolites could be fitted with a two-compartment model and obeyed first-order kinetics. Conclusion: After oral administration of tertiary butylhydroquinone, the peak time of tertiary butylhydroquinone-sulfate and tertiary butylhydroquinone-glucuronide in the serum of rats were 0.17ˉ0.61 h and 0.23ˉ0.74 h, the distribution half-lives 0.32ˉ1.11 h and 0.2ˉ2.60 h, and the elimination half-lives 11.75ˉ24.54 h and 24.42ˉ55.78 h, respectively. The concentrations of two metabolites in the serum of male rats were higher than those in female rats. The exposure of two metabolites increased in a less-than-dose-proportional manner. Moreover, the metabolism of tertiary butylhydroquinone in rats reached saturation with increasing dose.

tertiary butylhydroquinone-sulfate；tertiary butylhydroquinone-glucuronide；metabolic kinetics；liquid chromatography-mass spectrometry

TS201.6；TS202.3

A

1002-6630(2012)03-0220-05

2011-03-16

郝鵬鵬(1979—)，女，講師，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩?、環(huán)境衛(wèi)生。E-mail：haopengpeng@gmail.com