微量測定木聚糖酶活力的新方法
——MBTH法

張永勤，王 斐，曾凡偉，王哲平，張 杰，趙 鑫，程 千

(青島科技大學化工學院，山東 青島 266042)

微量測定木聚糖酶活力的新方法
——MBTH法

張永勤，王 斐，曾凡偉，王哲平，張 杰，趙 鑫，程 千

(青島科技大學化工學院，山東 青島 266042)

建立一種木聚糖酶活力的微量測定新方法——3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法。根據(jù)木聚糖及其酶解產(chǎn)物的特殊性，研究MBTH法的顯色條件，并以多點測定法對酶活力測定中的幾個關(guān)鍵參數(shù)進行探討。結(jié)果表明：蛋白質(zhì)在其質(zhì)量濃度低于30μg/mL時對測定無干擾；木聚糖溶液的最佳測定質(zhì)量濃度為4mg/mL；較高的酶解溫度會使木聚糖酶在測定過程中失活，因此，酶活力測定的最佳溫度為30℃，而遠低于該酶的最適溫度；酶解時間為60min以內(nèi)；酶解產(chǎn)物與MBTH試劑的反應時間應控制在13～16min之間，以15min為最佳。以酶解時間為30min計，本法檢測限為0.135mU/mL，定量限為0.451mU/mL，適當延長酶解時間可相應提高酶活力檢測靈敏度。該法準確度高，結(jié)果穩(wěn)定，靈敏度遠高于DNS法。

木聚糖酶；M B T H；活力；木聚糖；木糖；測定

木聚糖是一種多聚五碳糖，是植物半纖維素的重要組成成分，是自然界中繼纖維素之后含量第二豐富的可再生資源。木聚糖酶是一類降解木聚糖分子中β-1,4木糖苷鍵的酶系，是可將木聚糖水解為低聚木糖、木寡糖、木二糖以及少量阿拉伯糖和木糖的一種復雜的復合酶系統(tǒng)[1]，因而廣泛應用于生物能源、食品、飼料、制藥、制漿、造紙、紡織等行業(yè)中，已成為國內(nèi)外眾多學者的研究熱點[2-5]。

酶活力是衡量酶生物活性的重要指標，也是控制木聚糖酶制劑產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵參數(shù)。目前常用DNS法[6-8]測定其酶活力，此法雖然簡便、快捷，但靈敏度相對較低，特別不適用于酶含量極低的含酶材料的酶活力測定。本實驗所采用的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法常用于檢測酚類和醛類化合物[9-10]，以及漆酶和錳過氧化物酶活力的測定[11-12]，MBTH還可與含羰基的化合物反應[13]，且測定不受低濃度醋酸鹽和琥珀酸鹽緩沖液的干擾，因此可用于檢測木聚糖酶活力。由于該法靈敏度較高，在木聚糖酶解程度極低的條件下即可測得酶活力，而水解產(chǎn)物中大分子糖鏈的還原端基不會因分子質(zhì)量的略微變化而有大的反應性改變，即不同聚合度的同類還原糖，其還原端的顯色吸光系數(shù)基本相同，因此，所得活力測定數(shù)值不會像DNS法那樣偏離測定真值[14-15]。近年來有人將其應用于幾丁質(zhì)酶、溶菌酶的活力測定[16]，而將其用于木聚糖酶的活力測定還是一種新的嘗試。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

木聚糖酶(最適pH值為5.5) 和氏璧生物技術(shù)有限公司；木糖、木聚糖(來源于櫸木)、3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)、二硫蘇糖醇(DTT) 美國Sigma公司。

SHZ-82水浴恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司；FE 20數(shù)字酸度計 梅特勒-托利多儀器有限公司；UNICO 2100紫外-可見光分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司；移液器 賽默飛世爾(上海)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 木聚糖溶液的配制

準確稱取木聚糖0.8000g于100mL燒杯中，逐滴加入50mL水，使其浸潤并分散于水中，于80℃加熱直至完全溶解，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至容量瓶中，并以水定容至50mL。以0.1mol/mL pH5.5的醋酸緩沖溶液為溶劑，將定容好的木聚糖溶液轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，并定容至100mL，充分混勻，配成8mg/mL的木聚糖溶液于4℃貯藏備用。

1.2.2 還原糖濃度的測定及木糖標準曲線的繪制

以MBTH為氧化劑代替通常采用的DNS來測定還原糖濃度，其原理為，MBTH首先與還原糖反應生成嗪，過量的MBTH被Fe3+氧化成氧離子，在與嗪反應生成青藍色化合物，在一定范圍內(nèi)，還原糖的量和反應液的顏色強度呈正比關(guān)系，通過測定波長650nm處的吸光度表示還原糖濃度。在相同的還原糖濃度條件下，MBTH的氧化產(chǎn)物不同于DNS的氧化產(chǎn)物(橙黃-棕紅色的氨基化合物)，且其色度明顯深于后者。

MBTH法：參照木糖質(zhì)量濃度測定方法[17]并略加改動。取0.6mL木糖溶液或酶解液加入到0.6mL 0.5mol/mL NaOH溶液中，充分混勻，加入0.6mL MBTH試劑(3mg/mL MBTH溶液和1mg/mL DTT溶液等量混合即得，現(xiàn)用現(xiàn)配)，混勻后于80℃水浴中加熱15min 后趁熱加入1.2mL硫酸鐵銨試劑(0.5g/100mL (FeNH4(SO4)2)·12H2O、0.5%氨基磺酸、0.5mol/L鹽酸)，顯色穩(wěn)定后于650nm波長處測定其吸光度。每個樣品做3個平行樣(以下同)。其中，用于標準曲線的繪制的0.6mL木糖溶液(0～30 μ g/mL)由0.3mL的木聚糖溶液(1.2.1節(jié)配制)和0.3mL的具有不同質(zhì)量濃度系列的木糖溶液(0～60 μg/mL)構(gòu)成。

DNS法：參照國家標準GB/T 23874——2009《飼料添加劑木聚糖酶的活力的測定》[18]。

1.2.3 蛋白質(zhì)對還原糖濃度測定的影響

將2mg/mL牛血清白蛋白溶液以對倍稀釋法配制成不同質(zhì)量濃度溶液，再分別與20 μg/mL木糖標準溶液等體積混合，按照1.2.2節(jié)的方法測定還原糖濃度。

1.2.4 酶活力測定

多點測定法(罐法)：用于考察溫度、時間對酶活力測定的影響。將預熱至一定溫度的0.1mL木聚糖酶溶液(以50mmol/mL pH5.5的醋酸溶液為溶劑)加入到預熱至相同溫度的9.9mL 4mg/mL木聚糖溶液中起始酶解反應，定時取出2mL酶解液加入到2mL 0.5mol/L的NaOH溶液中以終止反應，充分混勻，分別取出1.2mL(做3個平行樣)，參照1.2.2節(jié)的方法測定還原糖濃度。在考察溫度對酶活力測定的影響和MBTH顯色反應時間對酶活力測定的影響中，木聚糖酶質(zhì)量濃度均為10μg/mL(即終質(zhì)量濃度均為0.1μg/mL)，后者的酶解時間為20min左右。

終點測定法(試管法)：用于常規(guī)活力測定。將預熱至30℃的0.3mL木聚糖酶溶液加入到預熱至相同溫度的0.3mL木聚糖溶液中充分混合以起始酶解反應(混合后木聚糖溶液質(zhì)量濃度為4mg/mL)，30min后，準時加入0.6mL 0.5mol/L的NaOH溶液中以終止酶解反應，充分混勻，參照1.2.2節(jié)的方法測定還原糖濃度。在考察酶解產(chǎn)物顯色后的穩(wěn)定性實驗中，木聚糖酶質(zhì)量濃度均為0.2μg/mL (即終質(zhì)量濃度為0.1μg/mL)。

酶活力單位可被定義為：在上述條件下，使每毫升酶解液中每分鐘產(chǎn)生1μmoL相當于木糖的還原糖的量為1個酶活力單位。

1.2.5 酶質(zhì)量濃度曲線的建立及方法驗證初步

以0.05mol/L的醋酸緩沖液(pH5.5)為溶劑配制不同質(zhì)量濃度的木聚糖酶溶液，使木聚糖酶在酶解液中的終質(zhì)量濃度分別為0、0.01、 0.03、 0.05、 0.07、 0.1、 0.15、0.2、 0.3μg/mL，參照1.2.4節(jié)的多點測定法進行酶活力測定。檢測限(DL)和定量限(QL)是由回歸直線方程確定[19]，由方程(1)和(2)計算所得。

式中：Sb1是10個空白溶液的標準偏差；b為回歸方程的斜率。

2 結(jié)果與分析

2.1 木糖標準曲線的繪制

木聚糖酶可催化木聚糖水解產(chǎn)生具有還原性木糖端基的低聚木聚糖，通過測定其還原端基或還原糖濃度的增加速率即可推算酶活力。以MBTH為氧化劑代替通常采用的DNS來測定還原糖濃度。

圖1 木糖標準曲線Fig.1 Standard curves of xylose prepared using DNS or MBTH as oxidizer

由圖1可知，其測定的靈敏度高于DNS法10倍以上。由于酶活力測定的靈敏度取決于相應還原糖測定的靈敏度，因此，利用MBTH法進行木聚糖酶活力的測定可顯著提高測定靈敏度。針對MBTH 法測定木聚糖酶解產(chǎn)物還原端基以及木聚糖酶活力測定的具體特點，實驗對木聚糖酶活力測定中的幾個關(guān)鍵參數(shù)進行了研究。

2.2 蛋白質(zhì)對酶活力測定的影響

有些多糖水解酶活力測定方法如BCA法[20]，其檢測試劑會與蛋白質(zhì)發(fā)生顯色反應，從而致使酶本身對顯色反應產(chǎn)生干擾，因此需考察蛋白質(zhì)對MBTH法測定的干擾情況。由于木聚糖的酶水解產(chǎn)物的還原端基為木糖，所以以木糖為例，配制不同蛋白質(zhì)量濃度相同木糖質(zhì)量濃度(10μg/mL)的木糖標準溶液，來考察蛋白質(zhì)對該方法的干擾情況，結(jié)果如圖2所示。當?shù)鞍踪|(zhì)量在250μg/mL以上時，白蛋白對測定干擾嚴重，而低于30μg/mL時，基本無干擾。在實驗文所建立的木聚糖酶活力測定方法中，木聚糖酶的質(zhì)量濃度在5μg/mL以下，因此不會干擾酶活力測定。

圖2 蛋白質(zhì)對還原糖測定的影響Fig.2 Effect of protein concentration on the determination of reducing sugar

2.3 MBTH顯色反應時間對酶活力測定的影響

圖3 MBTH與還原糖端基反應時間對酶活力測定的影響Fig.3 Effect of reaction time between MBTH and reducing sugar ends on the determination of xylanase activity

考察MBTH與酶解產(chǎn)物反應的時間對測定的影響，分別測定80℃水浴條件下，反應5、10、15、20、25、30、35、40min 時反應產(chǎn)物吸光度的變化，結(jié)果見圖3，反應時間為13～16min內(nèi)吸光度基本保持恒定，為了減少木聚糖本身的非酶熱降解程度，因此顯色反應時間定為15min。

2.4 反應產(chǎn)物顯色后的穩(wěn)定性

考察顯色反應后溶液吸光度隨時間的變化，分別測定顯色反應后室溫放置不同時間的吸光度，結(jié)果見表1。盡管顯色后試劑空白與樣品的吸光度都會略有變化，但減去空白后的樣品吸光度在1～5h內(nèi)變化較小。

表1 顯色反應后的產(chǎn)物穩(wěn)定性Table 1 Stability of chromogenic reaction products

2.5 酶解溫度和時間對酶活力測定的影響

由于酶的最適溫度是由多種因素相互影響而產(chǎn)生的綜合結(jié)果，因此，用于酶活力測定的酶解溫度不能簡單地以酶的最適溫度為測定條件。以木聚糖酶為例考察不同酶解溫度和時間條件下的酶解動力學。

圖4 酶解溫度和時間對酶活力測定的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on the determination of xylanase activity

由圖4可知，在相同酶解時間內(nèi)，盡管在37、45、55℃條件下所得酶解產(chǎn)物都明顯多于30℃，但是由于酶解速率隨時間延長而逐漸降低，按照常規(guī)所采用的試管法(終點法)很難準確測得酶解初速率。這主要是因為高溫容易使蛋白質(zhì)變性，從而引起酶活力降低，而且，溫度越高，酶蛋白變性越明顯。而酶解溫度為30℃時，曲線方程為一階線性方程，即為零級反應，產(chǎn)物生成速率基本保持恒定，在60min內(nèi)不受時間和底物質(zhì)量濃度的影響。而當溫度低于30℃時(如25℃)，首先底物木聚糖溶液的黏度較高，底物與酶很難充分混合，從而影響酶解動力學進程；其次低溫下木聚糖酶活力較低，會降低測定的靈敏度；另外，對測定的環(huán)境條件以及實驗設備會有更高的要求，較難達到。因此木聚糖酶初速率的最佳測定溫度為30℃，時間在60min以內(nèi)。也有文獻選擇在37℃條件下進行酶解測定，由圖4可知，酶解時間最好不要超過20min。但對于熱穩(wěn)定性較高的木聚糖酶，則可使用37℃，并可適當延長酶解時間。

2.6 底物質(zhì)量濃度對酶活力測定的影響

由圖5可知，隨著木聚糖底物質(zhì)量濃度的升高，還原糖生成速率逐漸升高，當木聚糖質(zhì)量濃度為2.5～4mg/mL時還原糖生成速率基本保持穩(wěn)定。由于定量測定酶活力一般要求底物質(zhì)量濃度盡可能大，但考慮到底物質(zhì)量濃度過大時，其自身還原糖濃度較高從而使本底顏色過深而影響測定，因此，確定木聚糖質(zhì)量濃度為4mg/mL，以便于木聚糖酶初速率的測定。

圖5 木聚糖質(zhì)量濃度對酶活力測定的影響Fig.5 Effect of xylan concentration on the determination of xylanase activity

2.7 酶質(zhì)量濃度對酶活力測定的影響及酶質(zhì)量濃度標準曲線的建立

圖6 不同酶質(zhì)量濃度條件下的動力學曲線Fig.6 Kinetic curve of xylanase with various concentrations

圖7 木聚糖酶質(zhì)量濃度曲線Fig.7 Calibration curve of xylanase concentration

由圖6可知，在該酶質(zhì)量濃度范圍內(nèi)酶解動力學曲線呈線性，為零級反應，酶解速率與底物質(zhì)量濃度無關(guān)，因此，可視為酶解初速率。以在上述條件下酶解30min所測酶解液中木聚糖酶活力的線性回歸方程(吸光度-木聚糖酶質(zhì)量濃度)為y＝2.8426x＋0.0084，R2＝0.9983，如圖7所示。其木聚糖酶質(zhì)量濃度檢測限為0.00316μg/mL，根據(jù)線性回歸方程(還原端基酶解初速率-酶質(zhì)量濃度) y＝22.065x＋0.0656， 其酶活力檢測限為0.135mU/mL，則定量限為0.451mU/mL。由于酶活力檢測的靈敏度取決于還原糖測定的靈敏度，因此，可通過適當延長酶解時間來測定較低的酶質(zhì)量濃度。

3 結(jié) 論

利用多點測定法研究了木聚糖酶的酶解參數(shù)，并優(yōu)化了酶解產(chǎn)物的顯色條件，從而建立了木聚糖酶活力定量測定的新方法—MBTH法。其最佳測定條件為：在木聚糖酶的最適pH值條件下，木聚糖酶酶解溫度為30℃，底物質(zhì)量濃度4mg/mL，酶解時間在60min以內(nèi)；在80℃條件下酶解產(chǎn)物與MBTH的反應時間應控制在13～16min之間，以15min為最佳。通過多點測定法對整個酶解過程的動力學研究，優(yōu)化測定參數(shù)，以保證在一定酶解時間內(nèi)使酶解速率保持恒定，從而可以將測定參數(shù)應用于試管法(終點法)以保證酶活力測定的準確性。

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A Novel Method for Determining Trace Amounts of Xylanase Activity: MBTH

ZHANG Yong-qin，WANG Fei，ZENG Fan-wei，WANG Zhe-ping，ZHANG Jie，ZHAO Xin，CHENG Qian (College of Chemical Engineering, Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266042, China)

A novel method for the quantitative determination of trace amounts of xylanase activity was established. The chromogenic conditions were explored according to the properties of xylan and its hydrolysates. The effects of several key hydrolysis parameters on the determination of xylanase activity were investigated by multiple-point procedures. The results showed that protein concentrations less than 30μg/mL did not interfere with the determination of xylanase activity. The optimal xylan concentration for the determination of xylanase activity was 4 mg/mL. High hydrolysis temperatures could inactivate xylanase. The most appropriate temperature for determining xylanase activity was 30 ℃, much lower than the optimal reaction temperature. The hydrolysis time was controlled within 60 min. The reaction time between hydrolysates and MBTH reagent was 13－16 min with the optimal level of 15 min. Based on 30 min hydrolysis, the detection limit and quantitation limit of the method were 0.135 mU/mL and 0.451 mU/mL, respectively. Properly prolonged hydrolysis time could improve the sensitivity of the method. The method was accurate, stable and even more sensitive than the DNS method.

xylanase；MBTH；activity；xylan；xylose；determination

Q814.9

A

1002-6630(2012)03-0044-04

2011-02-19

張永勤(1965—)，女，教授，博士，主要從事酶工程、生化分析研究。E-mail：zyq0205@qust.edu.cn