蔡恒江，唐學璽

(1.大連海洋大學海洋科技與環(huán)境學院，遼寧大連116023;2.遼寧省高校近岸海洋環(huán)境科學與技術重點實驗室，遼寧大連116023;3.中國海洋大學海洋生態(tài)學研究室，山東青島266003)

赤潮是全球性的海洋生態(tài)災害。近年來，中國近岸海域赤潮發(fā)生的頻率、波及范圍和危害程度呈上升趨勢。赤潮不僅會破壞海洋漁業(yè)資源和生產(chǎn)，惡化海洋環(huán)境，影響海濱旅游業(yè)，而且有一些藻類在生長過程中會排放出毒素，對人類生活直接造成危害，即形成有害赤潮HAB。因此，赤潮已成為當前污染生態(tài)學的研究熱點之一［1］。由于在赤潮的發(fā)生和消亡過程中各種理化因子和生態(tài)因子相互作用的復雜性，目前還沒有找到非常理想的治理方法。利用海洋環(huán)境中的生物因子進行赤潮的防控已經(jīng)越來越引起人們的重視［2－3］，其中利用大型海藻與微藻間的相互作用來預防或控制赤潮是一個新的研究方向［4］。大量研究表明，孔石莼與微藻種群之間會發(fā)生克生作用［5－6］，這為利用生物學方法控制赤潮的發(fā)生提供了可能。

用孔石莼進行赤潮防控的同時，其自身生長也會受到赤潮微藻的影響。但現(xiàn)今研究多集中于孔石莼對赤潮微藻的克生作用，而赤潮微藻對孔石莼生長的影響報道較少。研究表明，孔石莼可能會分泌某種克生物質(zhì)抑制赤潮微藻的生長［7］，但赤潮微藻對孔石莼作用途徑的研究尚未見報道。本研究中，作者選用大型海藻——孔石莼和赤潮微藻——赤潮異彎藻為試驗材料，研究了藻體、培養(yǎng)液濾液和胞內(nèi)物質(zhì)對生長相互作用的影響，以期找出孔石莼與赤潮異彎藻間的相互作用途徑，為赤潮防治的生物操縱法的研究提供有價值的資料。

1 材料與方法

1.1 材料

孔石莼Ulva pertusa采自青島太平角，采回后立即用天然海水洗凈，用打孔器打成直徑為1.3 cm的圓片。

赤潮異彎藻Heterosigma akashiwo取自中國海洋大學微藻培養(yǎng)中心，屬赤潮藻種。

1.2 方法

試驗前將孔石莼在室溫下預培養(yǎng)7 d(光照強度為3000 lx)。試驗在室內(nèi)光照培養(yǎng)箱中進行，培養(yǎng)溫度為 (20±1)℃，光照強度為3000 lx，光周期為12L∶12D。每個試驗均設4個平行。

1.2.1 孔石莼與赤潮異彎藻間的克生作用試驗

1)孔石莼對赤潮異彎藻生長的影響試驗。分別取0、0.05、0.10、0.20、0.40 g孔石莼接種于150 mL f/2培養(yǎng)液中，使其初始接種量分別達到0(對照)、0.33、0.67、1.33、2.67 g/L。赤潮異彎藻在指數(shù)生長期接種 (以下同)，接種的初始密度為1萬個/mL，分別接種到含不同初始質(zhì)量孔石莼的培養(yǎng)液中進行試驗［8］。

2)赤潮異彎藻對孔石莼生長的影響試驗。取0.05 g孔石莼接種于150 mL f/2培養(yǎng)液中，使其初始接種量達到0.33 g/L。赤潮異彎藻接種的初始密度分 別 為 0(對 照)、0.5、1.0、2.0、4.0萬個/mL，分別接種到孔石莼培養(yǎng)液中進行試驗。

1.2.2 孔石莼與赤潮異彎藻間的濾液交叉培養(yǎng)試驗

1)孔石莼濾液對赤潮異彎藻生長的影響試驗。分別取0、0.05、0.10、0.20、0.40 g孔石莼接種于150 mL f/2培養(yǎng)液中，使其初始接種量分別達到0、0.33、0.67、1.33、2.67 g/L。培養(yǎng)12 d后，取出孔石莼，培養(yǎng)液經(jīng)孔徑為0.45 μm的玻璃纖維素濾膜過濾得到孔石莼濾液，然后經(jīng)f/2營養(yǎng)鹽加富后作為赤潮異彎藻的培養(yǎng)液。赤潮異彎藻接種的初始密度為1.0萬個/mL，分別接種到150 mL含不同質(zhì)量的孔石莼濾液中。

2)赤潮異彎藻濾液對孔石莼生長的影響試驗。赤潮異彎藻初始接種密度分別為 0、0.5、1.0、2.0、4.0萬個/mL。培養(yǎng)12 d后，以6000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)孔徑為0.45 μm的玻璃纖維素濾膜過濾得到赤潮異彎藻濾液，然后經(jīng)f/2營養(yǎng)鹽加富后作為孔石莼的培養(yǎng)液。取0.05 g孔石莼接種于150 mL f/2培養(yǎng)液中，使其初始接種量達到0.33 g/L后進行試驗。

1.2.3 孔石莼與赤潮異彎藻間胞內(nèi)物質(zhì)的交叉培養(yǎng)試驗

1)孔石莼胞內(nèi)物質(zhì)對赤潮異彎藻生長的影響試驗。取孔石莼30 g，加少許消毒海水研磨成漿，以6000 r/min離心10 min后，取上清液0、1、2、4、8 mL分別加入150 mL f/2培養(yǎng)液中，相當于培養(yǎng)液中分別含有0(對照)、3.33、6.67、13.33、26.67 g/L的孔石莼胞內(nèi)物質(zhì)。赤潮異彎藻初始接種密度為1.0萬個/mL，分別接種于含不同接種量的孔石莼胞內(nèi)物質(zhì)的培養(yǎng)液中進行試驗。

2)赤潮異彎藻胞內(nèi)物質(zhì)對孔石莼生長的影響試驗。把培養(yǎng)12 d的赤潮異彎藻溶液以6000 r/min離心10 min，棄上清液，取沉淀的赤潮異彎藻加入消毒海水中，使藻細胞重懸浮于溶液中。用消毒海水來調(diào)解藻細胞的密度，分別為0(對照)、5.0、10.0、20.0、40.0萬個/mL，然后再使用超聲波使藻細胞完全破碎。分別取150 mL含不同密度的赤潮異彎藻的破碎液進行f/2營養(yǎng)鹽加富，各接入0.05 g孔石莼，使其初始接種量達到0.33 g/L后進行試驗。

1.2.4 孔石莼的稱重與赤潮異彎藻細胞密度的測定 每3 d取樣進行測定，取樣后每個培養(yǎng)瓶中補充f/2培養(yǎng)液，以消除可能產(chǎn)生的營養(yǎng)鹽限制［9］。

用吸水紙把孔石莼表面的水吸干后稱重。微藻用Lugol碘液固定，采用平板計數(shù)法，在Olympus雙筒顯微鏡下進行細胞計數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 11.0進行統(tǒng)計分析?？资簧L的抑制率 (IU)按下式計算:

其中:Uc為t時間對照組孔石莼質(zhì)量 (g);Ut為t時間處理組的孔石莼質(zhì)量 (g);U0為試驗初始孔石莼的質(zhì)量 (g)。

赤潮異彎藻生長的抑制率 (IH)按下式計算:

其中:Hc為 t時間對照組赤潮異彎藻的密度 (萬個/mL);Ht為t時間處理組赤潮異彎藻的密度 (萬個/mL);H0為試驗初始赤潮異彎藻的密度 (萬個/mL)。

2 結果

2.1 孔石莼與赤潮異彎藻間的克生作用

2.1.1 孔石莼對赤潮異彎藻生長的影響 孔石莼對赤潮異彎藻的生長有明顯的影響。從圖1可見:試驗第6～12天時，接種孔石莼的4個處理組赤潮異彎藻的生長都受到了極顯著的抑制 (P＜0.01);隨著孔石莼初始接種量的增加，抑制作用愈加明顯，第 12天時，接種量為 0.33、0.67、1.33、2.67 g/L的4組孔石莼對赤潮異彎藻生長的抑制率分別為38.9%、70.6%、81.6%、84.%。

2.1.2 赤潮異彎藻對孔石莼生長的影響 赤潮異彎藻對孔石莼的生長有明顯的影響。從圖2可見:試驗第9天時，接種赤潮異彎藻的4個處理組孔石莼的生長都受到了極顯著的抑制 (P＜0.01);隨著赤潮異彎藻初始接種密度的增加，抑制作用愈加明顯，第12天時，接種密度為0.5、1.0萬個/mL的兩組孔石莼的生長要明顯好于接種密度為4.0萬個/mL的組 (P＜0.01)，接種密度為0.5、1.0、2.0、4.0萬個/mL的4組赤潮異彎藻對孔石莼生長的抑制率分別為30.25%、39.64%、49.82%、57.49%。

圖1 不同初始接種量的孔石莼對赤潮異彎藻生長的影響Fig.1 Effects of U.pertusa with diffierent inoculated initial weights on the growth of H.akashiwo

圖2 不同初始接種密度的赤潮異彎藻對孔石莼生長的影響Fig.2 Effects of H.akashiwo in diffierent inoculated initial cell density on the growth of U.pertusa

2.2 孔石莼與赤潮異彎藻間的濾液交叉培養(yǎng)試驗

2.2.1 孔石莼培養(yǎng)液濾液對赤潮異彎藻生長的影響 孔石莼培養(yǎng)液濾液對赤潮異彎藻生長有明顯的影響。從圖3可見:試驗第12天時，除孔石莼初始接種量為0.33 g/L組外，其它3個處理組赤潮異彎藻的生長都受到了極顯著的抑制 (P＜0.01);隨著孔石莼初始接種量的增加，其培養(yǎng)液濾液對赤潮異彎藻生長的抑制作用愈加明顯，第12天時，接種量為0.67、1.33、2.67 g/L的3組孔石莼濾液對赤潮異彎藻生長的抑制率分別為8.05%、19.69%、39.73%。

2.2.2 赤潮異彎藻培養(yǎng)液濾液對孔石莼生長的影響 不同初始接種密度的赤潮異彎藻培養(yǎng)液濾液對孔石莼生長有明顯的影響。從圖4可見:隨著赤潮異彎藻初始接種密度的增加，孔石莼生長受到其培養(yǎng)液濾液的影響增大;第12天時，接種赤潮異彎藻密度為2.0、4.0萬個/mL的兩組孔石莼的生長受到了極顯著的抑制 (P＜0.01)，接種密度為0.5、1.0、2.0、4.0萬個/mL的4組赤潮異彎藻濾液對孔石莼生長的抑制率分別為1.64%、10.24%、15.97%、19.45%。

圖3 不同初始接種量的孔石莼培養(yǎng)液濾液對赤潮異彎藻生長的影響Fig.3 Effectsofculture medium filtratesfrom U.pertusa with diffierent inoculated initial weights on the growth of H.akashiwo

圖4 不同初始接種密度的赤潮異彎藻培養(yǎng)液濾液對孔石莼生長的影響Fig.4 Effectsofculture medium filtratesfrom H.akashiwo in diffierent inoculated initial cell density on the growth of U.pertusa

2.3 孔石莼與赤潮異彎藻間的胞內(nèi)物質(zhì)交叉培養(yǎng)試驗

2.3.1 孔石莼胞內(nèi)物質(zhì)對赤潮異彎藻生長的影響不同濃度的孔石莼胞內(nèi)物質(zhì)對赤潮異彎藻生長有明顯的影響。從圖5可見:第12天時，接種孔石莼胞內(nèi)物質(zhì)的4個處理組中，除3.33 g/L組赤潮異彎藻的生長受到的抑制不顯著外 (P＞0.05)，其它3組均受到了極顯著的抑制 (P＜0.01);隨著孔石莼胞內(nèi)物質(zhì)濃度的增加，胞內(nèi)物質(zhì)對赤潮異彎藻生長的抑制作用愈加明顯，第12天時，濃度為3.33、6.67、13.33、26.67 g/L的4組孔石莼胞內(nèi)物質(zhì)對赤潮異彎藻生長的抑制率分別為4.87%、6.35%、44.80%、69.16%。

圖5 不同濃度的孔石莼胞內(nèi)物質(zhì)對赤潮異彎藻生長的影響Fig.5 Effects of intracellular products from U.pertusa at diffierent concentrations on the growth of H.akashiwo

2.3.2 赤潮異彎藻胞內(nèi)物質(zhì)對孔石莼生長的影響赤潮異彎藻胞內(nèi)物質(zhì)對孔石莼生長的影響亦明顯。從圖6可見:赤潮異彎藻初始接種密度越大，其胞內(nèi)物質(zhì)對孔石莼生長的影響就越大;第9天時，赤潮異彎藻胞內(nèi)物質(zhì)濃度為 20.0、40.0萬個/mL的兩組孔石莼的生長受到了極顯著的抑制 (P＜0.01);第12天時，赤潮異彎藻胞內(nèi)物質(zhì)濃度為10.0萬個/mL的組孔石莼的生長也受到了極顯著的抑制 (P＜0.01)，濃度為 5.0、10.0、20.0、40.0萬個/mL的4組赤潮異彎藻胞內(nèi)物質(zhì)對孔石莼生長的抑制率分別為8.57%、20.74%、46.76%、56.09%。

3 討論

3.1 孔石莼與赤潮異彎藻間的克生關系

克生是指一種植物通過向環(huán)境中釋放某些化學物質(zhì)，在其周圍形成一個微環(huán)境區(qū)域，從而抑制或促進該區(qū)域內(nèi)其它植物生長的現(xiàn)象［10］。Nan等［11］研究了孔石莼對8種海洋微藻的克生作用，結果表明，孔石莼對海洋微藻的克生效應是普遍存在的。已有研究表明，孔石莼對赤潮異彎藻的生長存在明顯的抑制作用［1，12］，但海洋微藻對孔石莼生長的克生作用卻少見報道［6］，而赤潮異彎藻對孔石莼生長的影響未見報道。本試驗結果表明，孔石莼不僅對赤潮異彎藻的生長有明顯的抑制作用，赤潮異彎藻對孔石莼的生長亦有明顯的抑制作用，隨著赤潮異彎藻初始接種密度的增加，抑制作用愈加明顯，說明孔石莼與赤潮異彎藻間存在克生效應。

圖6 不同濃度的赤潮異彎藻胞內(nèi)物質(zhì)對孔石莼生長的影響Fig.6 Effects of intracellular products from H.akashiwo at various concentrations on the growth of U.pertusa

3.2 孔石莼與赤潮異彎藻間的相互作用途徑

種群之間的相互作用和相互競爭一般通過兩種方式和途徑進行，一種是細胞的直接接觸抑制，另一種是通過分泌次生物質(zhì)來完成對其它種群的抑制作用［12］。本試驗中，孔石莼培養(yǎng)液濾液和胞內(nèi)物質(zhì)對赤潮異彎藻生長均有明顯的抑制作用，且隨著孔石莼初始接種量和胞內(nèi)物質(zhì)濃度的增加，對赤潮異彎藻生長的抑制作用愈加明顯。這與前人的報道相似［7，13］?？梢酝茰y，孔石莼可以通過分泌次生物質(zhì)來完成對赤潮異彎藻生長的抑制，而抑制物質(zhì)存在于藻體和培養(yǎng)液中。微藻培養(yǎng)液濾液和胞內(nèi)物質(zhì)對孔石莼生長的影響目前尚未見報道。本試驗中發(fā)現(xiàn)，赤潮異彎藻培養(yǎng)液濾液和胞內(nèi)物質(zhì)對孔石莼的生長亦有明顯的抑制作用，且隨著赤潮異彎藻初始接種密度和胞內(nèi)物質(zhì)濃度的增加，對孔石莼生長的抑制作用愈加明顯?？梢酝茰y，赤潮異彎藻也可以通過分泌次生物質(zhì)來抑制孔石莼的生長，而這些抑制物質(zhì)存在于藻體和培養(yǎng)液中。本試驗中觀察發(fā)現(xiàn)，赤潮異彎藻全部附著在孔石莼上 (圖7)。顏天等［14］的研究也證明，赤潮異彎藻是通過細胞的直接接觸來抑制其它種群的生長，所以推測，赤潮異彎藻對孔石莼的抑制作用也可能是通過細胞的直接接觸完成的。

圖7 附著赤潮異彎藻的孔石莼Fig.7 The U.pertusa attached by H.akashiwo

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