殼寡糖種衣劑的制備及其對玉米防御酶系的影響

馬 鏑，金 星，趙新華，李春紅，曹敏建

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧 沈陽 110866）

玉米絲黑穗病是絲軸黑粉菌引起的世界性重要病害，在中國北方春玉米產(chǎn)區(qū)發(fā)生較為嚴(yán)重[1]。殼寡糖是植物識別病源真菌入侵的非特異性信號，對許多植物顯示強(qiáng)烈的誘導(dǎo)活性可激發(fā)植物的自身抗性[2]。當(dāng)玉米受到微生物侵染時，會啟動自我防御響應(yīng)以抵抗病原菌進(jìn)攻，這種自我防御能力可以由外源性寡糖誘導(dǎo)產(chǎn)生，激活玉米防御酶系活性，提高自身抵抗力。

早期對玉米絲黑穗病的研究主要集中在生物學(xué)特性、發(fā)生條件、防治方法等方面[3]。近期出現(xiàn)了對玉米絲黑穗病抗性機(jī)制的研究，如對根系滲出物、Vc和總糖含量與病菌互作的研究，還有對玉米絲黑穗病菌侵染后的寄主防御酶系活性變化的研究[4]，但對于殼寡糖誘導(dǎo)抗性的研究未見報道。試驗(yàn)研究了殼寡糖種衣劑和化學(xué)種衣劑處理的玉米在接種和不接種玉米絲黑穗病菌的狀態(tài)下，其防御酶系活性的變化。以期為生產(chǎn)上減少化學(xué)農(nóng)藥使用量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 玉米品種為先玉335。

1.1.2 土 樣 采自長白山土壤，共收集25份樣品，采集后自然晾干后置于4℃冰箱保存。

1.1.3 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基：殼聚糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏2 g/L，用土壤浸出液配制。

平板分離培養(yǎng)基：殼聚糖5.0 g/L，KH2PO42.2 g/L，Na2HPO4·12H2O 1.0 g/L，（NH4）2SO40.8 g/L，NaNO31.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl20.01 g/L，KCl 1.5 g/L，蛋白胨 0.5 g/L，酵母膏 0.5 g/L，瓊脂15 g/L，pH值6.0，殼聚糖溶液應(yīng)事先調(diào)至pH值6.0，并與其他成分分開滅菌后混和。

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，pH值自然。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KCl 1.5 g/L，KH2PO41.9 g/L，Na2HPO4·12H2O 0.9 g/L，Na2SO41.5 g/L，CaCl20.01 g/L，調(diào)至pH值6.5。

復(fù)篩搖瓶培養(yǎng)基：平板分離培養(yǎng)基中不加瓊脂，另外加入葡萄糖5 g/L，其他相同。

1.2 儀器

日本島津紫外-可見分光光度計（UV-12002）；H1TACHI低溫離心機(jī)（CR21G）。

1.3 土壤產(chǎn)殼聚糖酶菌株的篩選

1.3.1 富集培養(yǎng) 取各個土樣各約9 g，置于加有100 mL無菌水和玻璃珠的三角瓶中，30℃振蕩（180 r/min）30 min，使樣品充分打散后，放置沉淀，取上清液5 mL，加入到事先滅過菌的富集培養(yǎng)基中，28℃搖瓶富集培養(yǎng)3 d。

1.3.2 菌株分離 以殼聚糖為唯一碳源，用稀釋平板法分離富集后的樣品。于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d，然后選擇在培養(yǎng)基上形成的透明圈直徑與菌落直徑的比值較大的菌落進(jìn)一步進(jìn)行復(fù)篩。

1.3.3 菌種純化 將菌株分離后得到的斜面培養(yǎng)基內(nèi)的菌株接入種子培養(yǎng)基中30℃振蕩（120 r/min）培養(yǎng)2 d后，用接種環(huán)取少量菌株樣品接入平板固體培養(yǎng)基，采用平皿劃線分離法對菌株進(jìn)行純化，于30℃培養(yǎng)2～6 d后得到的單菌落接入斜面培養(yǎng)基。

1.3.4 透明圈法篩選 將菌種純化得到的斜面培養(yǎng)基內(nèi)純化好的菌株用滅菌后的牙簽點(diǎn)接種于平板分離培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)2～3 d，將菌落周圍透明圈稍大者挑出，接入斜面培養(yǎng)基。于30℃培養(yǎng)2～3 d，觀察產(chǎn)生的透明圈。

1.3.5 復(fù)篩搖瓶培養(yǎng)法篩選 將透明圈法篩選得到的斜面培養(yǎng)基內(nèi)菌株接入種子培養(yǎng)基中，30℃振蕩（120 r/min）培養(yǎng)2 d后，取8%接種量接入菌種篩選搖瓶培養(yǎng)基，30℃振蕩（120 r/min）培養(yǎng)，不同時間檢測酶活力。

1.4 殼寡糖的制備

取30.0mL 1.0%的膠體殼聚糖，加入30.0mL pH值5.0乙酸緩沖液稀釋的30.0 mL巨大芽孢桿菌BS-506發(fā)酵酶液，55℃反應(yīng)2 h后，沸水浴10 min終止反應(yīng)，加入0.25mol/L NaOH 10.0mL，使未完全反應(yīng)的殼聚糖沉淀，離心，去除沉淀，上清液經(jīng)冷凍干燥制成粉末，配成2%的殼寡糖溶液。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計

試驗(yàn)共設(shè)4個處理：處理1為15%立克秀，處理2為30%頂苗新，處理3為2%殼寡糖，處理4為空白對照（CK）。各處理均分為接種和不接種玉米絲黑穗病菌兩種方式，3次重復(fù)，總計24個小區(qū)。每個小區(qū)播兩行，每埯2粒，株距0.25 m，行距0.6 m，行長6 m，每小區(qū)面積為7.2 m2，試驗(yàn)區(qū)總面積為172.8m2。

1.6 種植方法

將每種藥液按定量慢慢沿?zé)诩尤氪鬅瓋?nèi)，并將稱取的50倍藥液重量的種子加入燒杯，用手握住燒杯順時針方向甩轉(zhuǎn)，直至藥液與種子充分混合均勻，杯壁內(nèi)側(cè)干凈無藥為止，使藥液均勻地附著在種子表面，拌好的種子晾干。

2011年5月12日播種，采用壟上埯播，播種時，按0.1%加入絲黑穗病菌粉與菌土充分混勻，開穴后先放種子，然后每埯蓋菌土100 g。

1.7 粗酶液的提取

分別取8種處理的玉米品種先玉335第3葉，去葉脈后，各稱取1 g，－20℃冰箱保存，待測。同時，配置0.2mol/L pH值8.8的硼酸緩沖液500mL。取出冰箱中的樣品，放入預(yù)冷的研缽中，加入1.5 mL硼酸緩沖液，冰浴中充分研磨后，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管，用1.5mL上述緩沖液沖洗，合并倒入預(yù)冷的5mL 離心管中，10 000 r/min，4℃離心 20min，上清液即為酶粗提取液。將酶粗提取液迅速倒出，放入－20℃冰箱中保存待用。

1.8 玉米防御酶系活性測定

過氧化物酶（POD）活性測定參照李合生等[5]方法。超氧化物歧化酶（SOD）活性測定參照Giannoplitis和Ries[6]及劉鴻先等[7]的方法。多酚氧化酶（PPO）活性測定參照李靖[8]方法。苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性測定參照Koukol和Cornn[9]方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)殼聚糖酶菌株篩選結(jié)果

在富集培養(yǎng)基中，以殼聚糖為唯一碳源，通過對各個土樣的富集培養(yǎng)，能利用殼聚糖的微生物大大增加，而不能利用的則大部分被淘汰。采用透明圈法，在以殼聚糖為唯一碳源的平板上篩選分離得到了9株產(chǎn)殼聚糖酶菌株。經(jīng)菌落觀察和鏡檢，大部分為霉菌，少數(shù)是細(xì)菌和酵母菌。在培養(yǎng)過程中，挑選菌落生長良好，透明圈明顯的菌落繼續(xù)培養(yǎng)，產(chǎn)生的透明圈不斷增大。

圖1 SH-0109菌株產(chǎn)生的透明圈

選擇透明圈直徑和菌落直徑比值（D/d）較大的9個菌落為出發(fā)菌株，進(jìn)一步進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，48 h后測定發(fā)酵液的殼聚糖酶酶活，結(jié)果表明SH-0109為產(chǎn)殼聚糖酶最好的菌株，菌落直徑為4.0mm，透明圈直徑30.0mm，透明圈直徑與菌落直徑的比值為7.5，酶活力為0.55 U/mL。

2.2 種衣劑對玉米葉片POD活性的影響

過氧化物酶（POD）在植物機(jī)體防御體系中起重要作用，不僅參與了木質(zhì)素的聚合過程，也是細(xì)胞內(nèi)重要的內(nèi)源活性氧清除劑，結(jié)果表明（圖2），無論在接種區(qū)還是非接種區(qū)，殼寡糖種衣劑都能提高POD酶活性。使用殼寡糖，POD酶活在接種區(qū)達(dá)28.02 U/mg，非接種區(qū)達(dá)27.57 U/mg，均比對照的POD酶活高。殼寡糖種衣劑可提高POD的活性。因此，可以通過殼寡糖部分取代化學(xué)農(nóng)藥，提高植物體過氧化物酶的活性。

圖2 種衣劑對玉米POD活性影響

2.3 種衣劑對玉米葉片SOD活性的影響

SOD是一種活性氧清除酶類，是植物細(xì)胞內(nèi)防御酶系統(tǒng)的重要成員之一。使用殼寡糖種衣劑，SOD酶活在接種區(qū)達(dá)156.72 U/mg，非接種區(qū)達(dá)150.19 U/mg，均比對照（處理4）的SOD酶活高。試驗(yàn)結(jié)果表明（圖3），無論在接種區(qū)還是非接種區(qū)，均表現(xiàn)為殼寡糖種衣劑對SOD酶活提高幅度更大。因此，可以通過殼寡糖部分取代化學(xué)農(nóng)藥，提高植物體自身的防御酶活。

圖3 種衣劑對玉米SOD活性影響

2.4 種衣劑對玉米葉片PPO活性的影響

PPO是一種抗病反應(yīng)次生代謝酶類，主要參與酚類氧化為醌以及木質(zhì)素前體的聚合作用，與植物抗病密切相關(guān)。結(jié)果表明（圖4），無論在接種區(qū)還是非接種區(qū)，均表現(xiàn)為殼寡糖種衣劑對PPO酶活提高幅度更大。使用殼寡糖種衣劑，PPO酶活在接種區(qū)達(dá)456.72 U/mg，非接種區(qū)達(dá)440.19 U/mg，均比對照的PPO酶活高。殼寡糖種衣劑可提高PPO的活性。因此，可以通過殼寡糖部分取代化學(xué)農(nóng)藥，提高植物體自身的防御酶活，減低化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境的污染。

圖4 種衣劑對玉米PPO活性影響

2.5 種衣劑對玉米葉片PAL活性的影響

PAL是植物苯丙烷類次生代謝途徑總路第一步關(guān)鍵酶，是苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶和限速酶，它催化苯丙氨酸脫氨基后產(chǎn)生肉桂酸并最終轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素，因此它是與細(xì)胞內(nèi)木質(zhì)素生成和沉積有關(guān)的防御酶。使用殼寡糖種衣劑，PAL酶活在接種區(qū)達(dá)308.72 U/mg，非接種區(qū)達(dá)303.19 U/mg，均比對照（處理4）的PAL酶活高。殼寡糖種衣劑可提高PAL的活性。結(jié)果表明（圖5），在接種區(qū)和非接種區(qū)均表現(xiàn)為殼寡糖種衣劑對PAL酶活提高幅度更大。

圖5 種衣劑對玉米PAL活性影響

3 結(jié)論與討論

植物的抗病性一般包括植物細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累與清除、抗病信號的產(chǎn)生與轉(zhuǎn)導(dǎo)、防衛(wèi)反應(yīng)的表達(dá)與調(diào)控等。在這一復(fù)雜過程中，一些酶類起著很重要的調(diào)控作用，相關(guān)酶類包括活性氧清除酶類和抗病反應(yīng)次生代謝酶類。宋瑞芳等[10]研究認(rèn)為POD是催化脂肪族、芳香族和酚類化合物氧化及木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶之一。PAL是植物抗性物質(zhì)生成途徑莽草酸途徑中酚類物質(zhì)、植保素、木質(zhì)素等抗菌物質(zhì)合成過程中最關(guān)鍵的酶類。PAL是誘導(dǎo)酶，是植物抗病代謝（莽草酸途徑）的關(guān)鍵酶和定速酶，POD不僅參與木質(zhì)素的聚合反應(yīng)，而且是細(xì)胞內(nèi)重要的內(nèi)源活性氧清除劑，PPO是酚類物質(zhì)氧化的主要酶，酚類物質(zhì)氧化產(chǎn)生醌類或參與木質(zhì)素的合成，以殺死或抑制病原菌的繁殖而起到抗病作用，SOD能消除超氧自由基而對細(xì)胞具有保護(hù)作用。

殼寡糖種衣劑作為生物農(nóng)藥在玉米上的報道較少，關(guān)于其誘導(dǎo)玉米自身抗性的研究還未見報道。該研究為進(jìn)一步探討其誘導(dǎo)抗性機(jī)制提供了依據(jù)。研究結(jié)果表明，經(jīng)由立克秀或定苗新處理后4種酶活性均較對照稍低，表明化學(xué)農(nóng)藥對玉米的防御酶系活力有一定傷害；而殼寡糖處理玉米種子之后，植株的防御酶系（PAL、POD、PPO、SOD）活性普遍升高，表明殼寡糖能夠誘導(dǎo)植物的信號系統(tǒng)，啟動植株體內(nèi)防御酶系的表達(dá)。殼寡糖通過調(diào)整植物抗病基因的活化，使玉米產(chǎn)生對玉米絲黑穗病的抗性，并非直接作用于病原菌的抑菌反應(yīng)。因此，在病原菌侵入前進(jìn)行殼寡糖種子處理，才能達(dá)到防病的效果。

[1] 張小飛，高增貴，莊敬華，等.玉米絲黑穗病菌致病性分化研究[J].玉米科學(xué)，2010，18（2）：100-103.

[2] 趙龍杰，徐翠蓮，韓富根，等.殼寡糖席夫堿對煙草花葉病毒的誘導(dǎo)抗性[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（5）：131-133.

[3] 時俊光，王作英，陳曉旭.幾種玉米種衣劑對玉米絲黑穗防治效果篩選試驗(yàn)研究[J].雜糧作物，2010，30（2）：136-137.

[4] 賀字典，高增貴，莊敬華，等.玉米絲黑穗病菌對寄主防御相關(guān)酶活性的影響[J].玉米科學(xué)，2006，14（2）：150-151，155.

[5] 李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，2000.164-165.

[6] Giannoplitis C N,Ries S K.Superoxide dismutase:I.Occurrence in higher plants[J].Plant Physiol,1997,59:309-314.

[7] 劉鴻先，曾韶西，王以柔.低溫對不同耐寒力的黃瓜子葉各細(xì)胞器中超氧物歧化酶的影響[J].植物生理學(xué)報，1985，（11）：46-57.

[8] 李 靖，利容千，袁文凈.黃瓜感染霜霉病菌葉片中一些酶活性的變化[J].植物病理學(xué)報，1991，12（4）：227-283.

[9] Koukol J,Cornn E E.Themetabolism of aromatic compounds in higher plants IV. Purification and propcities of the phenylalanine-deaminase of Herdeum vulagare[J].Journal of Biological Chemistry,l961,23:2692-2698.

[10] 宋瑞芳，丁永樂.煙草抗病性與防御酶活性間的關(guān)系研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2007，23（5）：309-314.